| 研究課題/領域番号 |
22K06817
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
黒田 有希子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任講師 (70455343)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 骨芽細胞 / 感覚器 / 聴覚 / 耳小骨 / 骨密度 / 石灰化 / 骨形成 |
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| 研究実績の概要 |
これまでの骨研究分野では、骨が如何にして身体を支え、動かすかという骨の運動器としての機能や代謝を中心に解析が行われてきた。その一方で、申請者は中耳に存在する耳小骨の研究を通し、聴覚に関連する骨が独自の形態形成や代謝制御をとることで感覚器の機能を最大限に引き出していることに気付いた。そこで本研究では、聴覚に関連する骨と一般的な長管骨を比較解析し、「感覚器に関連する骨がその機能に特化した形態や性質を獲得している」という仮説を証明することを目指す。
一般的な長管骨と同様に、聴覚関連骨も軟骨原基が石灰化骨に置き換わる内軟骨性骨化により骨形成が進行する。しかし、聴覚関連骨と長管骨では骨を形成する骨芽細胞のサブタイプが異なり、その結果、骨密度や骨基質成分の異なる骨であることが判明した。
初年度は、聴覚関連骨を形成している「聴覚骨芽細胞」と一般的な骨芽細胞の具体的な差異を明らかにするために、聴覚関連骨および大腿骨から同一の骨芽細胞マーカーを指標として骨芽細胞を分取し、各骨芽細胞のRNAシークエンスを行い、遺伝子発現パターンを比較解析することに取り組んだ。骨芽細胞の純度を高めるために、骨芽細胞が蛍光たんぱく質でラベルされたトランスジェニックマウスを用いたが、マウス耳小骨はわずか数ミリ程度の小さな骨であるために、その小さな骨から骨芽細胞の採集方法を確立するまでに時間がかかった。また、聴覚に特化した「振動を伝える」という機能が聴覚関連骨の形成や維持、および骨密度に及ぼす影響を調べるために、マイクロCTよりも解像度の高いナノCTを用いて立体構造や骨密度を正確に観察する方法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者はマウス聴覚関連骨の中で、聴覚骨芽細胞のみによって骨が形成されているのは耳小骨（中耳）と骨迷路（内耳）であり、一部の聴覚関連骨には一般的な骨芽細胞も混在していることを発見した。そのため、聴覚骨芽細胞を単離するサンプルには耳小骨と骨迷路のみを用いた。また、骨芽細胞マーカーのうち、オステオカルシンは聴覚骨芽細胞でも一般的な骨芽細胞でも発現していることを確認した。そこで、純度の高い骨芽細胞を採集するために、オステオカルシンプロモーターの下流で緑色蛍光タンパク質(topaz)を発現するトランスジェニックマウス（BGLAP-tpz）を使用し、蛍光強度を指標に、骨芽細胞を分離することを計画した。聴覚骨芽細胞を集めるためには耳小骨と骨迷路を、一般的な骨芽細胞を集めるためには長管骨である大腿骨と脛骨をコラゲナーゼで処理し、topazの蛍光強度を指標としてセルソーティングを行った。その結果、いずれのサンプルにおいてもtopaz強陽性と弱陽性の２種類の細胞群があった。長管骨の骨芽細胞を用いたRNAシークエンスの結果から、topaz強陽性が骨形成能をもつ骨芽細胞であることが分かった。以上の結果から、長管骨由来、および耳小骨と骨迷路由来の骨芽細胞の遺伝子発現パターンを比較する際には、topaz強陽性の細胞を用いることとした。耳小骨と骨迷路から回収できた骨芽細胞数は大腿骨に比べて極めて少なかったため、RNAシークエンスに必要なRNA量を回収するまでに時間がかかったが、本年度内に聴覚骨芽細胞由来のRNAも解析することができた。
また、耳小骨など小さな骨はマイクロＣＴの解像度では、正確な骨密度計測ができなかったが、ナノＣＴを用いて撮影条件や検量線の設定、CT再構築時の条件設定などを検討することで、正確な骨密度の定量が可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNAシークエンスの結果を用いて、聴覚骨芽細胞と一般的な骨芽細胞における発現遺伝子の比較解析を行う。聴覚骨芽細胞が形成する骨は一般的な骨芽細胞が形成する骨と何が違うのか、を明らかにするために1）聴覚骨芽細胞に特異的に発現している遺伝子の探索、2）石灰化度や細胞外マトリクス、細胞接着に着目したパスウェイ解析、を行う。遺伝子発現解析の結果、聴覚骨芽細胞に特異的な発現が見られた遺伝子や高骨密度制御の遺伝子に関しては、切片による免疫染色でタンパク質の発現パターンを確認する。RNAシークエンスは再現実験を行う必要があるため、BGLAP-tpzマウスの繁殖と飼育は継続する。
聴覚関連骨は形態そのものが「振動を伝える」という機能に特化していると考えられる。その形態の制御機構を理解するためには、切片などの平面で組織学的解析を行うだけでは不十分であり、骨形成に関わる細胞群や血管、神経などを三次元的に捉える必要がある。そのため、ホールマウント免疫染色や透明化を行い、骨形態形成の制御に関わる細胞群の三次元解析を行うことを目指す。また、聴覚異常と骨との関係を明らかにするために、難聴モデルマウスの解析も計画している。これらの解析のために、中耳・内耳の骨密度や骨形態に関する情報を取得するナノＣＴ撮影後に同じサンプルをホールマウント解析するプロトコールの確立を目指す。
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