| 研究課題/領域番号 |
22K06821
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
関 亮平 関西医科大学, 医学部, 助教 (40746624)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 有尾両生類 / 脊髄 / 再生 / 免疫細胞 |
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| 研究実績の概要 |
我々ヒトを含む哺乳類とは対照的に、イモリを含む有尾両生類では脊髄損傷後に自発的な組織再構築が起こり、軸索の再生を経てほぼ完全な神経機能が再建される。本研究では、有尾両生類が持つこの特異な再生能力のメカニズムを、免疫系が果たす役割に着目して明らかにすることを目的とする。
本年度は前年度に引き続き、イベリアトゲイモリ脊髄における免疫細胞の可視化を目的とした、交差性を示す抗体の選定と免疫染色プロトコルの構築を行った。本検証の実施にあたっては、脊髄に加え免疫細胞が豊富に存在する脾臓を用いた。その結果、T細胞やマクロファージ（ミクログリア）を薄切した脊髄サンプル上で可視化することが可能となった。現在、これらの抗体を用いて、脊髄損傷前後の免疫細胞数の変化を追っているところである。並行して、マクロファージのサブセット（M1およびM2）を識別するための別の抗体の選定も行っている。
また、脊髄損傷後のリンパ管再生の過程を解析するために、その可視化手法の確立にも取り組んだ。前年度より、リンパ管内皮細胞がProx1とLyve1の共陽性細胞として識別されるとの先行研究を参考に、これらのマーカーを免疫染色で可視化することを目指してきた。しかし、イベリアトゲイモリに交差性があると期待される市販抗体が乏しかったことから、発現細胞の可視化方法をin situハイブリダイゼーションへと変更し、RNAプローブ合成のための遺伝子クローニングに取り組んでいた。前年度までに2つの遺伝子のうちLyve1はクローニングができていなかったため、今年度はdegenerate primerによる増幅も試みた。しかしながら、未だにクローニングには至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究課題遂行のための基盤技術である免疫細胞やリンパ管の可視化手法の確立に時間を要したため、全体的に研究計画が後ろ倒しになっている。したがって、進捗状況は当初の計画より遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
PanT細胞とPanマクロファージの可視化が可能になったため、これらの細胞が脊髄損傷によりどのような応答を示すかを解析する。特に、マクロファージに関しては、M1とM2サブセットに大きな機能差があるという事実から、多少時間や金銭的なコストが掛かっても両者の識別を達成させたい。さらに、脊髄損傷後の応答の仕方から脊髄再生への関与が予想される免疫細胞を特定し、それを抗体投与によってイモリから除去した場合の再生への影響を評価する。
リンパ管の可視化に関しては、引き続きマーカー遺伝子のクローニングを試みるが、状況によっては多少リスクを負ってでも交差性保証のない抗体を購入することも検討する。脊髄損傷後のリンパ管再生の様子を明らかにし次第、VEGF-Cなどのリンパ管新生因子を脊髄損傷後に局所的に作用させることでリンパ管を過剰に形成させた場合の脊髄再生への影響を解析することを計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「研究実績の概要」欄に記載した通り、抗体の選定や遺伝子クローニングに時間を要したことにより、当初の計画通りに研究を展開することができなかったため。次年度はこれらの内容を早急に終え、脊髄損傷前後の免疫細胞数の定量やリンパ管再生の様子を明らかにしたい。さらには、脊髄再生への関与が想定される免疫細胞をイモリから除去し、その影響を評価することを計画している。次年度予算は、免疫細胞の可視化と除去のいずれにも必要となる抗体や組織染色用試薬等の消耗品の購入、動物の購入と維持費用、学会参加のための旅費に充てる。
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