バクテリオファージ尾部吸着分子によるディフィシル菌認識メカニズムの解明と応用

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K07074
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 阪口 義彦 北里大学, 医学部, 講師 (70403491)
• 研究分担者: 後藤 和義 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (20626593) ; 武 晃 北里大学, 医学部, 助教 (30818399) ; 大宮 直木 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00335035)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: Clostridioides difficile / C. difficile感染症 / バクテリオファージ / 宿主特異性 / 尾部吸着分子 / 腸内細菌叢 / 治療 / 予防

研究実績の概要

Clostridioides (Clostridium) difficile感染症（CDI）は、C. difficileが原因で発症する難治性の下痢症・腸炎である。その治療には抗菌薬が使用されるが、正常な腸内細菌叢の乱れによりCDIの再発を繰り返すことがある。従って、原因となるC. difficileのみを特異的に殺菌する新規治療法の確立が急務である。研究代表者らは、その治療候補の1つとしてバクテリオファージ（ファージ）に着目した。ファージは、自然界に普遍的に存在しており、宿主となる細菌に特異的に結合し殺菌活性を示す。本研究課題では、ファージの特性を利用したCDIの新規治療法の確立を目指し研究開発を行っている。本年度においては、ファージの宿主認識分子（尾部吸着分子）と推定した2つの遺伝子産物（Hisタグ融合ORFA、Hisタグ融合ORFB）のC. difficile リボタイプ027株に対する結合性について、enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) の条件検討を行った。一次抗体にHisタグ抗体を用いたELISAによる検出法では、非特異的な検出が認められた。そこで、精製His融合ORFAまたはHis融合ORFBを直接horseradish peroxidase（HRP）で標識し、C. difficileに対する結合性を調べたところ、時間依存的および濃度依存的に結合することが明らかとなった。現在、他のリボタイプ株に対する結合性について解析を行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究課題では、まず、精製した2つの組換えタンパク質（Hisタグ融合ORFA、Hisタグ融合ORFB）のClostridioides difficileに対する結合性について、ORFAまたはORFBに対する抗体を用いたenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) により評価する予定にしていた。本検出の中で、ORFAまたはORFBに対する抗体の作製には時間を要することから、ELISAでの検出に一次抗体としてHisタグ抗体を用いて検出することにした。しかしながら、Hisタグ抗体を用いることで、特異的な結合のみを検出することが困難であった。そこで、ORFAまたはORFBに直接horseradish peroxidase（HRP）標識することで、C. difficileに対する結合性を検出することにした。その結果、作製したHRP標識ORFAまたはORFBを用いることで、時間依存的および濃度依存的なC. difficileへの結合が認められた。現在、他のリボタイプに対する結合性についても調べている。

今後の研究の推進方策

研究代表者が単離したバクテリオファージ（ファージ）のClostridioide difficile に対する結合は、ファージのゲノム情報からORFAおよびORFBを含む数種のタンパク質（尾部吸着分子）が機能している可能性を考えた。そこで、ORFAおよびORFB以外のタンパク質を作製することが必要となった。本作製において、中型恒温振とう培養機を用いることで効率よく種々の組換えタンパク質を発現することが可能となる。発現したタンパク質のC. difficile に対する結合性を調べる。
1）推定した吸着分子をコードする遺伝子を人工遺伝子合成し、これを発現用ベクターに挿入する（プラスミド構築）。
2）本プラスミドを大腸菌発現系により組換えタンパク質（Hisタグ融合タンパク質）として発現させ、コバルトアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。
3）作製したHisタグ融合タンパク質のC. difficileに対する結合をEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) およびウエスタンブロット法により解析し、C. difficileに対する吸着分子の特異性を明らかにする。ウエスタンブロット法においては、画像解析装置一式を用いて作製した種々の吸着分子のC. difficileへの結合性を評価する。

次年度使用額が生じた理由

次年度の研究計画では、単離したバクテリオファージ（ファージ）のゲノム情報から推定した尾部吸着分子の機能解析を進める。今年度の未使用額は、次年度に繰り越して、本実験で使用する培地やアフィニティー担体などを購入し、研究を遂行することにした。また、研究分担者の未使用額も同様の目的で使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Lysyl oxidase-like 4 exerts an atypical role in breast cancer progression that is dependent on the enzymatic activity that targets the cell-surface annexin A2 (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakaguchi, M., Komalasari, N. L. G. Y., Tomonobu, N., Kinoshita, R., Chen, Y., Sakaguchi, Y., Gohara, Y., Jiang, F., Yamamoto, K., Murata, H., Ruma, I. M. W., Sumardika, I. W., Zhou, J., Yamauchi, A., Kuribayashi, F., Inoue, Y., Toyooka, S.
  • 雑誌名: Front. Oncol. 巻: 13 ページ: 1142907
  • DOI: 10.3389/fonc.2023.1142907
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Impact of body composition for patients with hepatocellular carcinoma who received atezolizumab plus bevacizumab therapy (2023)
  • 著者名/発表者名: Uojima, H., Chuma, M., Hidaka, H., Tsuda, T., Kobayashi, S., Hattori, N., Ogushi, K., Arase, Y., Take, A, Sakaguchi, Y., Ando, T., Nishigori, S., Watanbe, T., Numata, K., Morimoto, M., Kagawa, T., Kako, M., Kusano, C.
  • 雑誌名: Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fecal microbiota transplantation as therapy for recurrent Clostridioides difficile infection is associated with amelioration of delirium and accompanied by changes in fecal microbiota and the metabolome (2022)
  • 著者名/発表者名: Gotoh, K., Sakaguchi, Y., Kato, H., Osaki, H., Jodai, Y., Wakuda, M., Take, A., Hayashi, S., Morita, E., Sugie, T., Ito, Y., Ohmiya, N.
  • 雑誌名: Anaerobe 巻: 73 ページ: 102502
  • DOI: 10.1016/j.anaerobe.2021.102502
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Evaluation of skeletal muscle mass in patients with chronic liver disease shows different results based on bioelectric impedance analysis and computed tomography (2022)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi, N., Uojima, H., Hidaka, H., Iwasaki, S., Wada, N., Kubota, K., Nakazawa, T., Shibuya, A., Kako, M., Take, A., Sakaguchi, Y., Sato, T., Kusano, C.
  • 雑誌名: Ann. Nutr. Metab. 巻: 78(6) ページ: 336－344
  • DOI: 10.1159/000526563
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phylogenic analysis of new viral cluster of large phages with unusual DNA genomes containing uracil in place of thymine in gene-sharing network, using phages S6 and PBS1 and relevant uncultured phages derived from sewage metagenomics (2022)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama, J., Takemura-Uchiyama, I., Gotoh, K., Kato, S., Sakaguchi, Y., Murakami, H., Fukuyama, T., Kaneki, M., Matsushita, O., Matsuzaki, S.
  • 雑誌名: Virus Res. 巻: 319 ページ: 198881
  • DOI: 10.1016/j.virusres.2022.198881
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The change rate in serum nitric oxide may affect lenvatinib therapy in hepatocellular carcinoma (2022)
  • 著者名/発表者名: Kawamura, A., Uojima, H., Chuma, M., Shao, X., Hidaka, H., Nakazawa, T., Take, A., Sakaguchi, Y., Numata, K., Kako, M., Nozaki, A., Azuma, S., Horio, K., Kusano, C., Atsuda, K.
  • 雑誌名: BMC Cancer 巻: 22(1) ページ: 912
  • DOI: 10.1186/s12885-022-10002-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Antibiotic-resistant status and pathogenic clonal complex of canine Streptococcus canis-associated deep pyoderma (2022)
  • 著者名/発表者名: Imanishi, I., Iyori, K., Take, A., Asahina, R., Tsunoi, M., Hirano, R., Uchiyama, J., Toyoda, Y., Sakaguchi, Y., Hayashi, S.
  • 雑誌名: BMC Vet. Res. 巻: 18(1) ページ: 395
  • DOI: 10.1186/s12917-022-03482-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] C型とD型ボツリヌス毒素をコードするバクテリオファージのゲノム比較解析 (2023)
  • 著者名/発表者名: 阪口義彦、武 晃、後藤和義、山本由弥子、幸田知子、向本雅郁、小崎俊司、林 俊治、林 哲也、小熊惠二
  • 学会等名: 第96回日本細菌学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] ヒト糞便検体からの放線菌の分離とその生物活性評価 (2023)
  • 著者名/発表者名: 武 晃、阪口義彦、菊池雄太、稲橋佑起、後藤和義、林 俊治、坂本光央、大宮直木
  • 学会等名: 第96回日本細菌学会総会
• [学会発表] チミンの代わりにウラシルを含む珍しいゲノムDNAを有するジャイアントファージ群の系統的位置付け (2022)
  • 著者名/発表者名: 内山淳平、竹村伊代、後藤和義、加藤伸一郎、阪口義彦、村上裕信、福山朋季、金木真央、松下治、松崎茂展
  • 学会等名: 第10回ファージ研究会
• [学会発表] ヒト糞便検体からの放線菌の分離とその代謝産物解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 武 晃、阪口義彦、菊池雄太、稲橋佑起、後藤和義、坂本光央、林 俊治
  • 学会等名: 2022年度（第36回）日本放線菌学会大会
• [学会発表] チミンの代替えにウラシルを使用したDNAゲノムを有する巨大ブドウ球菌ファージS6を利用した関連ファージ群の系統分類 (2022)
  • 著者名/発表者名: 内山淳平、内山伊代、後藤和義、加藤伸一郎、阪口義彦、村上裕信、福山朋季、金木真央、松下治、松崎茂展
  • 学会等名: 第66回日本ブドウ球菌研究会