| 研究課題/領域番号 |
22K07086
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
村本 裕紀子 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (70436567)
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| 研究分担者 |
永樂 元次 京都大学, 医生物学研究所, 教授 (40415097)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | SARS-CoV-2 |
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| 研究実績の概要 |
2019年末から流行している新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の主な症状は上気道炎などの呼吸器症状であり、高齢者や基礎疾患患者では重篤な肺炎や呼吸困難を起こす。一方で、嗅覚/味覚障害や頭痛など、さまざまな神経障害を伴う症例が多数報告されている。特に、COVID-19から回復した後の長期的な後遺症（Long COVID）として、嗅覚/味覚障害、眩暈や記憶障害、ブレインフォグなど、神経障害が長期に続く例が多数報告されている。COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2（新型コロナウイルス）は、鼻腔や肺などのヒト呼吸器組織で効率よく増殖する。加えて、in vitroにおいて神経系培養細胞や脳オルガノイドに感染すること、また、COVID-19感染により亡くなった患者の皮質ニューロンにおいてもウイルス抗原が認められたことから、神経指向性があるとも考えられる。つまり、SARS-CoV-2の中枢神経系細胞への感染がヒトの神経障害の発症の要因の1つと考えられるが、SARS-CoV-2の中枢神経系細胞への感染メカニズムだけでなく、中枢神経系細胞における増殖機構やそれに対する宿主応答については十分には理解されていない。私たちはこれまでにSARS-CoV-2が中枢神経系細胞に感染し、増殖することを確認している。そこで、SARS-CoV-2が中枢神経系細胞に感染・増殖するために関与する宿主側の要因およびウイルス要因を明らかにする目的で研究を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SARS-CoV-2が中枢神経系細胞に感染することは示されているが、どのような経路でどのような宿主因子を利用して中枢神経系細胞に感染するかは未だ不明である。これまでに、SARS-CoV-2の感染・増殖にはメイン受容体Angiotensin converting enzyme 2 (ACE2)や表面糖蛋白質Sの開裂に働く宿主プロテアーゼ、加えてその他の宿主因子の関与が予想されているが、中枢神経系細胞感染における各宿主因子の重要性はほとんど明らかにされていない。そこで今年度は、これら宿主因子数種類を選択し、それぞれをノックアウトしたオルガノイドの作出を試みた。まず、Crispr-Cas9を用いてゲノム編集を行い、ヒトES細胞から各宿主因子遺伝子を欠損させた。そして遺伝子欠損細胞からゲノムDNAを採取し、宿主因子領域上流および下流のプライマーを使用してPCRを行い、ゲノムから宿主因子遺伝子が欠損されたことを確認した。そのヒトES細胞を用いて分化誘導を行い、オルガノイドを作出した。現在、オルガノイドで宿主因子が発現していないことを蛋白質レベルで確認しているところである。蛋白質レベルで宿主因子が発現していないことを確認できたら、SARS-CoV-2感染実験に使用する。したがって、順調に研究が進んでいると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、中枢神経系細胞に感染する際に重要な宿主因子を同定することを目的として、作出した宿主因子欠損オルガノイドにSARS-CoV-2を感染させ、ウイルスの増殖性を調べる計画である。ウイルス増殖が著しく抑制された場合には、該当の宿主因子がSARS-CoV-2の感染や増殖に重要であると考えられる。ウイルスが多少でも増殖した場合には、オルガノイドの免疫組織化学染色や発現解析により感染細胞を検出して細胞種を推定し、中枢神経系細胞であるかどうかを確認する。宿主因子を欠損していないオルガノイドへSARS-CoV-2を感染させた場合の感染細胞と比較することで、中枢神経系細胞への感染に重要な役割を持つ宿主因子や中枢神経系細胞への侵入経路を見出す。さらに、中枢神経系細胞で増殖した後のSARS-CoV-2の全遺伝子配列を解析して、中枢神経系細胞増殖後のウイルス遺伝子変異を同定することで、中枢神経系細胞への感染・増殖に関するウイルス側の要因を見出す計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は主に宿主因子欠損細胞の作出を行ったため、予定より使用金額が少なくなった。来年度は細胞からの分化誘導を頻繁に行い、オルガノイドを多数準備すること、さらに感染実験を行い、オルガノイドの発現解析を行うため、消耗品費および解析費を多く使用する計画である。
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