CTLA4の細胞内輸送を利用した疲弊化回避型CAR-T細胞の開発

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K07261
• 研究機関: 東京医科大学
• 研究代表者: 若松 英 東京医科大学, 医学部, 講師 (40632617)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: CAR-T細胞 / CTLA-4 / 疲弊化 / 腫瘍免疫 / 免疫記憶

研究実績の概要

キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞療法は、白血病、およびリンパ腫への適応が承認されており、寛解率の高さから他のがん種に対する臨床開発が進められている。しかし、移入したCAR-T細胞が疲弊化し、抗腫瘍効果が減弱することが報告されている。そのため、疲弊化を回避できるCARの創出が求められている。本研究ではCAR自身のCD3z（CAR-CD3z）の自発的なリン酸化によって惹起される能動的な疲弊化に注目し、CTLA-4の細胞内領域を挿入したCAR（CAR-CTLA-4.28z）を用いて、能動的疲弊化を回避するCAR-T細胞の創出を進めており、本年度は、以下の成果を得ている。1) 昨年に引き続き、CAR-CD3zのリン酸化、脱リン酸化とCAR分子の輸送との関係性について評価した。CAR-CD28.zは細胞表面でCAR-CD3zがリン酸化され、細胞内にエンドサイトーシスされることで脱リン酸化された。この結果から、CAR-CTLA-4.28zのCAR-CD3zのリン酸化の減弱はCTLA-4によるエンドサイトーシスの亢進に起因していることが強く示唆された。2) CTLA-4細胞内領域（CTLA4Cy）をCD28-CD3zの配列の後に挿入した場合でも、CAR-CD3zのリン酸化を減弱させるかを評価した。その結果、CTLA-4.28.zと異なり、CD28.CD3z.CTLA-4は、細胞表面への発現もCAR-CD3zのリン酸化もCAR-28.zとほとんど違いが認められなかった。3) CAR-CTLA-4.28zの in vivoでの抗腫瘍効果を評価した。血液がんモデルでは CAR-28.zと抗腫瘍効果にほとんど違いが認められなかったが、固形がんモデルではCAR-CTLA-4.28zがより強い抗腫瘍効果を示す傾向が認められた。現在、N数を増やして、再現性を確認している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

CAR-CD3zの自発的なリン酸化がCAR-T細胞で起こっていることが知られているが、リン酸化が惹起される場所（細胞表面、細胞内小器官）や細胞表面から細胞内にエンドサイトーシスされた後もリン酸化が持続するかは不明であった。昨年に引き続き、CAR分子の輸送、およびCTLA-4Cyの挿入部位とCAR-CD3zのリン酸化との関係性を評価し、エンドサイトーシスによってCAR-CD3zが減弱すること、CTLA-4の挿入部位によってCAR-CD3zのリン酸化が異なることを見出した。また、in vivoでのCAR- CTLA-4.28.z-T細胞の抗腫瘍効果はコントロールCAR-T細胞よりも強い可能性を示す結果が得られており、CAR-CD3zのリン酸化が能動的な疲弊化の誘導に寄与している可能性が示唆されている。現在、免疫不全マウス、野生型マウスにCAR-28.zおよびCAR- CTLA-4.28.z-T細胞を移入し、CAR-CD3zのリン酸化を介した能動的な疲弊化の回避、およびCAR-T細胞の記憶細胞への分化に関して、末梢血を単離し、経時的に解析を行なっている。In vivoに移入したCAR-T細胞のRNAseq解析を用いた網羅的な遺伝子発現解析、およびヒトT細胞を用いた解析は準備段階だが、それ以外に関しては計画通り進んでおり、進捗は概ね順調に進展していると評価した。

今後の研究の推進方策

本年度に引き続き、in vivoにおける能動的な疲弊化の回避、およびCAR-T細胞の記憶細胞への分化の解析を進め、遺伝子発現パターンの解析によるCAR-CTLA-4.28.z T細胞とCAR-28.z T細胞の質的違いを明らかにする。さらに、腫瘍細胞を複数回移植し、CAR-CTLA-4.28.zの有用性について検証していく。また、ヒトT細胞にCAR-CTLA-4.28.zを導入し、in vitro、およびNSGマウスを用いたin vivoでのCAR-T細胞の疲弊化の評価を行う。これまでの実験結果をまとめ、論文を作成していく。

次年度使用額が生じた理由

本年度は予定していたRNAseq解析、およびヒトCAR-T細胞解析が進められていないため、受託解析費用や新たな抗体の購入費用がなく、直接経費が予定よりも少なかった。次年度は、これらの解析、およびin vivo実験を進めていくため、持ち越しの予算も含め、予定通り直接経費を使用し、研究を進めていく。

研究成果

• [雑誌論文] Evaluation of therapeutic PD-1 antibodies by an advanced single-molecule imaging system detecting human PD-1 microclusters (2023)
  • 著者名/発表者名: Wataru Nishi, Ei Wakamatsu, Hiroaki Machiyama, Ryohei Matsushima, Kensho Saito, Yosuke Yoshida, Tetsushi Nishikawa, Tomohiro Takehara, Hiroko Toyota, Masae Furuhata, Hitoshi Nishijima, Arata Takeuchi, Miyuki Azuma, Makoto Suzuki, Tadashi Yokosuka
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 ページ: 1-16
  • DOI: 10.1038/s41467-023-38512-7.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] A novel mechanism for LAG-3-mediated cell-extrinsic suppression of CD4+ T cell activation through trogocytosis of MHC class II (2024)
  • 著者名/発表者名: Ei Wakamatsu, Hiroaki Machiyama, Hiroko Toyota, Masae Furuhata, Hitoshi Nishijima, Arata Takeuchi, Tadashi Yokosuka
  • 学会等名: 第52回日本免疫学会
• [学会発表] CD4/CD8 coreceptor binding to MHCs positively regulate CAR-T cell response via translocation of Lck into CAR microclusters. (2024)
  • 著者名/発表者名: Hiroaki Machiyama, Ei Wakamatsu, Arata Takeuchi, Hitoshi Nishijima, Maksim Mamonkin, Malcolm K Brenner, Tadashi Yokosuka
  • 学会等名: 第52回日本免疫学会
• [学会発表] Comparison of linear and parallel co-stimulatory signaling via CD28 in the activation of CAR-T Cells (2024)
  • 著者名/発表者名: Tetsushi Nishikawa1,, Arata Takeuchi, Hiroaki Machiyama, Ei Wakamatsu, Hitoshi Nishijima, Masae Furuhata, Hiroko Toyota, Wataru Nishi, Ryohei Matsushima, Yosuke Yoshida, Tadashi Yokosuka
  • 学会等名: 第52回日本免疫学会
• [学会発表] PD-1-mediated suppression of CAR-T cells via CAR signalosomes colocalized by PD-1 (2024)
  • 著者名/発表者名: Yosuke Yoshida1,2, Hiroaki Machiyama2, Ei Wakamatsu, Arata Takeuchi, Hitoshi Nishijima, Hiroko Toyota, Masae Furuhata, Ryohei Matsushima, Tetsushi Nishikawa, Tadashi Yokosuka
  • 学会等名: 第52回日本免疫学会
• [学会発表] Fine tuning of T cell activation by multistep regulation of CD6 and its ligand CD166. (2024)
  • 著者名/発表者名: Arata Takeuchi, Tatsushi Nishikawa, Hiroaki Machiyama, Ei Wakamatsu, Hitoshi Nishijima, Masae Furuhata, Hiroko Toyota, Ryohei Matsushima, Yosuke Yoshida, Tadashi Yokosuka
  • 学会等名: 第52回日本免疫学会