| 研究課題/領域番号 |
22K07271
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
松田 暁子 山形大学, 医学部, 講師 (10573272)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 膵癌 / IPMN / オルガノイド |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ヒト膵切除検体から作成した膵管上皮organoidにIPMNを特徴づける任意の遺伝子変異を導入した際の形質変化を反映した液性因子を解明する事を目的としている。
任意のcDNA配列を組み込んだplasmid DNAを作成し、Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G、Takara Bio）を用いてLenti virus vectorを作成した。KRASG12Dは既存のplasmidであるpBABE-Puro-KRas*G12Vを、GNASR201Hは、TrueORF cDNA Clone（OriGne）で作成したplasmidを用いた。7日～14日間培養したorganoidを回収しsingle cell化し、Matrigel(Corning)にsingle cellと作成したベクターを添加しtransfectionを行っているが、KRASG12Dについては安定した遺伝子導入が可能であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
正常膵管上皮オルガノイドの継代・維持に難渋し、手術標本から新規の正常膵管上皮オルガノイドを一定頻度で作成する必要が生じたため、予定より大幅な作業時間を要している。7日～14日間培養したorganoidを回収しsingle cell化し、Matrigelにsingle cellと作成したベクターを添加しtransfectionを行っているが、GNASR201Hの導入が不安定であり、導入効率についてtransfection環境の調整を継続的に行ってきた。いくつかGNASR201Hの導入に成功した株については、病理学的評価を行た。現在は、引き続きKRASG12DとGNASR201Hの両者のtransfectionを行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画では、令和4-5年にかけて、凍結保存済みの膵管上皮organoidを用いて3系統のorganoid樹立が完了している予定であったが、目標より遅れている状況である。2系統のorganoidまでは遺伝子導入が可能であったため、成功した株を優先的にヌードマウスへの移植、腫瘍形成能の評価まで行うため準備中である。また、IPMN手術検体からの樹立は症例があれば並行して行うが、IPMNガイドライン改定とともに得られ難い環境になっているため、基本的には当初の計画通りに遺伝子導入環境の調整と、成功株から次のステップに順次進むように進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子導入試薬やorganoid培養関連試薬は、他の研究でも用いているため、節約が可能であった。また、ヌードマウスへの移植や、以降の実験に進めていないため、次年度に予算を回す結果となった。
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