| 研究課題/領域番号 |
22K07305
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
濱田 大治 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (30771480)
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| 研究分担者 |
谷本 昭英 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (10217151)
横山 勢也 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (20569941)
比嘉 那優大 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (90792200)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 飽和ゲノム編集 / PDGFRA遺伝子 / 意義不明変異 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は本研究計画の根本をなす「一倍体細胞株を用いたPDGFRA遺伝子の飽和ゲノム編集」について検討を行った。
まず、用いる一倍体細胞株（HAP-1）のゲノム編集方法で用いるプラスミド、Cas9蛋白質およびドナーDNAであるssODNsのトランスフェクションの検討を行った。本細胞株は遺伝子導入が非常に困難な細胞株であると言われており、効率的な導入が飽和ゲノム編集の成否を左右することが想定される。様々な導入方法を検討した結果、エレクトロポレーションによりCas9蛋白質を導入しゲノム編集を行う方法が最も効率的であることを見出した。その上で、導入に用いるCas9蛋白質およびssODNの最適化を行った。
当初の研究計画ではゲノム編集はプライム編集により行うとされていたが、検討の結果から十分な編集効率を得ることができないことが判明した。そこで編集方法を研究計画で示した代替案である通常のCas9 nucleaseを用いて飽和ゲノム編集に切り替え、さらなる検討を行った。その結果、PDGFRA遺伝子のエクソン10における小規模な飽和ゲノム編集（9塩基連続の網羅的な一塩基置換）を行うことが可能であった。この飽和ゲノム編集が領域特異的なものでないことを確認するため、他のエクソン領域についても検討を順次行っている。今のところ、エクソン5でも同様に飽和ゲノム編集が可能であったことを確認しており、確立した実験方法は普遍的に飽和ゲノム編集が可能であることを示している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究計画の根幹をなす飽和ゲノム編集の実験方法を確立することができた。この実験方法が確立されたことによって、本研究計画は大筋で達成可能であると想定される。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に構築した飽和ゲノム編集方法について網羅的解析をさらに充実させるため、一度に行う塩基編集数の拡大について検討を行う。確立した9塩基飽和ゲノム編集を用いて、得られた結果からの解析方法、使用する薬剤の選定等、次のステップの検討を開始する。
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