腫瘍不均質性を考慮した細胞濃縮法の開発

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K07315
• 研究機関: 静岡県立静岡がんセンター(研究所)
• 研究代表者: 畠山 慶一 静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (20564157)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 腫瘍濃縮 / 次世代シーケンサ / 腫瘍不均質性 / 体細胞変異変異

研究実績の概要

次世代シーケンサを用いた腫瘍に対する変異解析は、研究のみならず臨床現場においても重要な位置づけになりつつある。変異解析において、腫瘍含有率は変異同定の成否を決める重要な因子の1つであり、腫瘍含有率が低い場合には正確に変異を検出できないことが分かっている。しかしながら、患者から切除された腫瘍組織には臓器由来の細胞をはじめ免疫関連の細胞も含まれているため、がん種によっては対象中に含まれる腫瘍細胞が少ない場合がある。さらに、腫瘍に不均質性がありサブクローナルな集団に蓄積している体細胞変異であれば、腫瘍含有率が低い症例ではその変異を見落とす可能性は高い。そこで本研究では、次世代シーケンサによる正確な体細胞変異の検出を目指した、腫瘍不均質性を考慮した簡便な細胞濃縮法の確立を目的とする。
予備実験で示されたホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片からびまん性胃がんの腫瘍細胞の濃縮・分離する基本コンセプトの特許出願を行った。この濃縮法は半全自動で実施でき、作業者の負担も少なく臨床のパネル検査にも実装できると考えている。
またその濃縮・分離技術を利用し、変異アレル頻度(VAF)が小さい変異の検出に成功した。これにより濃縮しない従来法では検出できなかった体細胞変異を数多く検出することができた。マクロダイセクションが困難であるびまん性胃がんにおいても体細胞変異の検出数を向上させることができた。さらに、腫瘍画分と残渣画分のVAFの差分を利用した生殖細胞系列変異を同定できることを実証した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究計画通りに、モデル実証としてホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片からびまん性胃がんの腫瘍細胞の濃縮・分離する技術を確立することができた。それにより腫瘍由来のDNAの相対量が増え、変異アレル頻度(VAF)が低い体細胞変異の検出が期待通りに可能になった。また、想定通り血液サンプル無しに個人の生殖細胞系列変異を推定できることも実証できた。それゆえ、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

研究計画通りに、腫瘍不均質性を考慮した腫瘍濃縮アプローチを開始する。また次世代シーケンサの解析から、この腫瘍細胞濃縮技術で新たにコピー数変化の検出も向上できる可能性が示された。そこで本研究と並行して応用発展としてコピー数変化にも注目した研究も同様に進める。また腫瘍含有量は、ロングリードの次世代シーケンサの解析にも影響を与えることがわかってきており、本濃縮技術でロングリードの次世代シーケンサのDNA品質を満たすことができるのかも併せて評価する。

次年度使用額が生じた理由

研究計画が順調に進行し、一部使用しない試薬が発生した。また、昨今の半導体不足の関係で、2022年度中に購入できなかった機器があった。そのため2022年度中に実施予定の実験が一部出来ず、2023年度に改めて実施予定のため次年度使用額が生じた。

研究成果

• [雑誌論文] Tumor cell enrichment by tissue suspension enables detection of mutations with low variant allele frequency and estimation of germline mutations (2022)
  • 著者名/発表者名: Hatakeyama Keiichi、Muramatsu Koji、Nagashima Takeshi、Kawanishi Yuichi、Fukumura Ryutaro、Ohshima Keiichi、Shimoda Yuji、Kenmotsu Hirotsugu、Mochizuki Tohru、Urakami Kenichi、Akiyama Yasuto、Sugino Takashi、Yamaguchi Ken
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 ページ: 2953
  • DOI: 10.1038/s41598-022-06885-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Novel tumor cell enrichment enables detection of mutations with low variant allele frequency (2022)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Hatakeyama, Keiichi Ohshima, Takeshi Nagashima, Sumiko Ohnami, Shumpei Ohnami, Masakuni Serizawa, Akane Naruoka, Koji Maruyama, Akira Iizuka, Tadashi Ashizawa, Hirotsugu Kenmotsu, Tohru Mochizuki, Kenichi Urakami, Yasuto Akiyama, Ken Yamaguchi
  • 学会等名: 第81回日本癌学会学術総会
• [産業財産権] 遺伝子変異の検出方法及び体細胞変異と生殖細胞系列変異とを区別する方法 (2022)
  • 発明者名: 畠山慶一、杉野隆、村松浩二、他7名
  • 権利者名: 静岡県、SRL・静岡がんセンター共同検査機構
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2022/031772
  • 外国