研究課題
自閉スペクトラム症(以下自閉症)は、社会的コミュニケーションの障害、常同的で反復的な行動、感覚（聴覚など）の変化などを特徴とする発達障害である。遺伝的な背景に環境要因が組み合わされた複合的な要因が大部分の自閉症発症の原因と推定されている。自閉症関連遺伝子にはシナプス関連遺伝子や、その遺伝子の発現調節にかかわる遺伝子が多く含まれる。それらの遺伝子は、細胞接着分子、足場タンパク質、シナプスの転写やタンパク質の合成・分解に関与するタンパク質をコードすることから、自閉症の症候の少なくとも一部は、シナプスの機能の変容に起因していると考えられる。実際に、自閉症患者の脳でシナプス後部である樹状突起スパイン密度の変化が観察され、自閉症モデル動物でシナプス可塑性の変異が報告されている (Bourgeron (2015) Nat. Rev. Neurosci.)。そこで、バルプロ酸投与マウスあるいはマーモセット自閉症モデルを用いて、シナプス機能の変容を解析することを通じて自閉症のメカニズムを明らかにすることを我々は目指している。2022年度はこれまでに明らかにした自閉症モデルマーモセットのシナプスの性質についてプレプリントサーバーで公表し、雑誌社に論文投稿しつつ、その対応を実施した。また、神経科学学会、生理研研究会、マーモセット研究会、神経研究所などにおいて口頭発表を行った。一方で、下記に示すように自閉症モデルの作出と、マウスからシナプトソームを精製し、RNA配列の次世代シーケンサーによる解析を実施した。また、活動シナプスを解析するためのタンパク質プローブのベクターの準備を完了し、現在発現の解析に進むところである。
2: おおむね順調に進展している
以下の事項について予定にしたがって進めた。◆自閉症モデル動物の作出：我々は、抗てんかん薬であるバルプロ酸を妊娠期のマーモセットにバルプロ酸を経口投与することによって、仔マーモセットとして自閉症モデル個体を作出している(Watanabe et al. (2021) Nat. Commun. doi: 10.1038/s41467-021-25487-6.参照)。同様に、バルプロ酸曝露自閉症モデルマウスも作出し、シナプトソームを精製し解析する実験を開始した。また、シナプトソームからRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いてシークエンスを行った。その結果RNA配列を読み取ることが可能であることを確認した。◆シナプス活動を検出するプローブの準備：cFos遺伝子は神経細胞の活動によって発現量が上昇する。この遺伝子の発現によって活動神経細胞をwestern blottingあるいは組織抗体染色で検出する条件設定を実施中である。一方、GCaMP6f等のカルシウム感受性蛍光タンパク質は神経細胞の活動を蛍光強度の変化として検出することを可能にする。シナプス活動プローブをコードするAAVベクターを作成し、2光子顕微鏡を用いた樹状突起の観察などで「社会性シナプス」を同定することを目論む。ベクターの作成は実施完了したので、次に発現の確認等に移行する。
◆コントロールマウスとバルプロ酸曝露ASDモデルマウスにおいて、シナプトソームを精製し、RNAならびにタンパク質を抽出し、それぞれ次世代シーケンサーによるRNA配列解析とwestern blotting 等による比較解析を実施する。◆シナプス活動プローブの動作の検証を実施する。マウスあるいはマーモセット組織に対する蛍光観察が可能か否かを検討し、局所LED近紫外線照射によってフォトコンバージョンが生じるか否かを確認する。◆マウスあるいはマーモセットの聴覚刺激あるいは社会性刺激によって、活動する脳領野をcFos抗体などの手段を用いて確認し、上記プローブによる活動シナプスのマーキングのテストを実施する。具体的には、マウス大脳皮質においてプローブを含むAAVを接種し、頭蓋骨に穴をあけてガラス観察窓を設け、チャンバーを頭蓋骨に接着しておく。プローブの発現を2光子顕微鏡を用いて確認する。被験個体は1-4週間群れから隔離し、その後、他個体と専用の観察箱にて所定時間対面させる（社会性刺激）。被験個体には紫外線照射用の光ファイバーを観察窓の外側に設置する。対面中一定の頻度で近紫外線を照射し、「社会性シナプス」にラベルする。時間後、麻酔下に２光子顕微鏡観察を行って、ラベルされた社会性シナプスを同定する。社会性刺激を再提示したときに再び社会性シナプスが活性化するか否かを確認する。同定した社会性シナプスを含む脳部位をホモジナイズし、シナプトソームを抽出する。我々はフローサイトメーターのソーティング機能を用いて、シナプトソームを蛍光を指標に分類する。これを用いて、赤色蛍光を持つ社会性シナプス由来のシナプトソームを濃縮・抽出する。抽出後、シナプトソームからRNAを精製でき、また、ウエスタンブロッティング法や質量分析といった手法で、社会性シナプスが含有する分子を解析する。
主たる理由: データ取得あるいは論文査読対応を優先したために、国際学会における発表を取りやめた。また消耗品は他の研究費で購入したものを流用するなどで余剰が生じた。 使用計画: 2022年度と同様、試薬等の消耗品や特注品の購入にあてる。次世代シークエンスの外注費用が相当数発生することが見込まれるので 充当する。
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BioRxiv
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10.1101/2022.08.24.505057.
