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2023 年度 実施状況報告書

遺伝性血栓症の病因(オミックス解析)と病態の解明

研究課題

研究課題/領域番号 22K07391
研究機関金沢大学

研究代表者

森下 英理子  金沢大学, 保健学系, 教授 (50251921)

研究分担者 小原 收  公益財団法人かずさDNA研究所, その他部局等, 副所長 (20370926)
荒磯 裕平  金沢大学, 保健学系, 准教授 (20753726)
研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
キーワード遺伝性血栓症 / アンチトロンビン(AT)欠乏症 / プロテインC(PC)欠乏症 / プロテインS(PS)欠乏症 / NGSパネル検査 / ノックアウトゼブラフィッシュ / 高速原子力間顕微鏡 / Liposome flotation assay
研究実績の概要

静脈血栓塞栓症(VTE)のリスク因子の一つである遺伝性血栓症においては、遺伝子バリアントの同定率はアンチトロンビン(AT)欠乏症約9割、プロテインC(PC)欠乏症5割、プロテインS(PS)欠乏症にいたっては3~4割程度である。このように、バリアントの同定率は標的遺伝子で異なり、原因不明も100例近くあり、現行法のDNA解析では確定診断に限界がある。そこで、遺伝性血栓症の病因解明のために、血栓性素因関連遺伝子群のNGSパネルを用いた遺伝子バリアントの同定、さらには標的遺伝子のRNAを用いたトランスクリプトーム解析や網羅的なプロテオーム解析を組み合わせたオミックス解析による検査法を確立することを目的とした。
①今年度は、かずさDNA研究所にてハイブリキャプチャー法により全対象遺伝子の蛋白質コードエクソンとそのイントロン境界部の塩基配列を決定する血栓性素因関連遺伝子群(54遺伝子)のNGSパネルを作成し、原因不明の血栓症患者33名について解析をおこなった。②凝固反応は全てリン脂質二重膜上で起こるが、これまでに脂質二重膜を形成して凝固因子との結合実験を行った報告は皆無である。Liposome flotation assay法を用いて、脂質二重膜と凝固因子の結合を直接検出するアッセイ系を構築した。さらに、高速原子力間顕微鏡(HS-AFM)を用いて、凝固因子とリン脂質膜の結合過程の動的解析を世界で初めて実施した。③AT欠乏症ホモ接合体は胎内致死をきたすため、マウスなどの哺乳類モデルによって解析することは困難である。そこで、初期胚が透明で生きたまま簡便に組織観察を行うことができるゼブラフィッシュを用いてゲノム編集を行いATノックアウト(KO)体を作成し、胎内致死変異の病態を解析するための新規ツールを開発した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

①血栓性素因関連遺伝子群(54遺伝子)のNGSパネルを用いて、原因不明の血栓症患者33名について解析をおこなった。既知の血栓症としては、PS・PC・AT欠乏のバリアントを全部で6例同定したが、興味深いことに、TFPIおよびアネキシンVの新規バリアントがそれぞれ1例ずつ同定され、血栓症との関連が強く示唆された。
②構築したLiposome flotation assayを用いて、脂質結合部位に変異を有するトロンビンとの脂質結合評価を行なった。リコンビナントプロトロンビンを高純度精製し、高速原子力間顕微鏡(HS-AFM)にてマイカ基板上でのプロトロンビンを観察した。その結果、全長0.8nmのタンパク質が多く確認され、1分子レベルでのプロトロンビンの撮影に世界で初めて成功した。また、マイカ基板上に生体膜を模したリン脂質二重膜を作製し、リン脂質膜辺縁部に結合したプロトロンビンを可視化することに成功した。さらに、経時的に観察を続け、プロトロンビンがリン脂質膜辺縁部に結合する過程をリアルタイムで撮影することにも成功した。
③ATノックアウト体はwild typeと比較すると生存期間が短縮していることを明らかにし、現在生存曲線を作成中である。ノックアウト体では明らかな血管系の異常は認めなかった。
④PC欠乏症について、human Gene Mutation Data Baseなどを用いて遺伝子バリアント部位と臨床情報をAIに入力し、新たな遺伝子バリアントについて血栓症の重症度など予測するモデルを作成し、日本血液学会に報告した。

今後の研究の推進方策

①血栓症との関連が想定されるTFPIならびにアネキシンVの変異遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え蛋白を作製し、発現実験を行う。変異蛋白が分泌される場合は、その機能解析を行い、血栓症を発症する機序を解明する。TFPI欠乏症ならびにアネキシンV欠乏症による血栓症についての詳細な検討は、世界初となる。
②HS-AFMにて、rPTがリン脂質二重膜の辺縁部に結合しやすい特性を認めたが、リン脂質膜辺縁と相互作用したrPTはマイカ基板上とも相互作用していると考えられ、生体内の反応とは異なる可能性がある。rPTがリン脂質膜の曲率を認識し、例えば凸部または凹部に結合しやすいなどの特性を明らかにするため、凹凸基板上にリン脂質二重膜を一面に作製し、rPTとリン脂質二重膜の結合動態をより詳細に解析する予定である。
③ATノックアウト体ゼブラフィッシュの血栓形成のライブイメージングや、赤血球や血小板、血管内皮に蛍光標識し、さらに詳細に血栓形成メカニズムを観察する。
④AIに遺伝子バリアントの部位と臨床情報をさらに多く入力し、新たな遺伝子バリアントについて血栓症の重症度など予測するモデルを作成する。

次年度使用額が生じた理由

試薬概算額と納品額の差額が生じたため。次年度の助成金と合わせて試薬購入費に充当する。

  • 研究成果

    (18件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 6件) 学会発表 (12件) (うち国際学会 2件、 招待講演 4件)

  • [雑誌論文] Platelet and large platelet ratios are useful in predicting severity of COVID-192024

    • 著者名/発表者名
      Sugihara Hisae、Marumo Atsushi、Okabe Haruka、Kohama Kiyotaka、Mera Takashi、Morishita Eriko
    • 雑誌名

      International Journal of Hematology

      巻: - ページ: -

    • DOI

      10.1007/s12185-024-03737-9

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Identification of two de novo variants causing inherited antithrombin deficiency by quantitative analysis of variant alleles2024

    • 著者名/発表者名
      Togashi Tomoki、Nagaya Satomi、Meguro-Horike Makiko、Matsumoto Haruto、Imai Yuta、Yamaguchi Koichi、Fujii Yoshinari、Moriya Haruka、Kikuchi Yuika、Yasuda Ibuki、Horike Shin-ichi、Morishita Eriko
    • 雑誌名

      Thrombosis Research

      巻: 233 ページ: 37~40

    • DOI

      10.1016/j.thromres.2023.11.016

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Thrombosis-related characteristics of pregnant women with antithrombin deficiency, protein C deficiency and protein S deficiency in Japan2024

    • 著者名/発表者名
      Kobayashi Takao、Sugiura Kazuko、Ojima Toshiyuki、Serizawa Mariko、Hirai Kyuya、Morishita Eriko
    • 雑誌名

      Thrombosis Journal

      巻: 22 ページ: -

    • DOI

      10.1186/s12959-024-00581-z

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Functional analysis of two abnormal antithrombin proteins with different intracellular kinetics2023

    • 著者名/発表者名
      Imai Yuta、Nagaya Satomi、Araiso Yuhei、Meguro-Horike Makiko、Togashi Tomoki、Horike Shin-ichi、Kawasaki Hiroshi、Morishita Eriko
    • 雑誌名

      Thrombosis Research

      巻: 230 ページ: 18~26

    • DOI

      10.1016/j.thromres.2023.08.010

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Protein S deficiency caused by cryptic splicing due to the novel intron variant c.346+5G>C in PROS12023

    • 著者名/発表者名
      Nagaya Satomi、Togashi Tomoki、Akiyama Masaharu、Imai Yuta、Matsumoto Haruto、Moriya Haruka、Meguro-Horike Makiko、Yasuda Ibuki、Kikuchi Yuika、Kuwajima Yamato、Horike Shin-ichi、Watanabe Atsushi、Morishita Eriko
    • 雑誌名

      Thrombosis Research

      巻: 229 ページ: 26~30

    • DOI

      10.1016/j.thromres.2023.06.020

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] The length of the sanitary napkins can be used as a handier index than pictorial blood loss assessment chart to predict the heavy menstrual bleeding2023

    • 著者名/発表者名
      Nagao Azusa、Tokugawa Tazuko、Matsuo Yoko、Shirayama Rie、Morishita Eriko、Nozima Masahiro、Kinai Ei、Nishida Yasuharu、Fukutake Katsuyuki
    • 雑誌名

      Journal of Obstetrics and Gynaecology Research

      巻: 49 ページ: 1838~1845

    • DOI

      10.1111/jog.15664

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 血栓性素因の診断のために行う検査2024

    • 著者名/発表者名
      森下 英理子
    • 学会等名
      第18回学術標準化委員会(SSC)シンポジウム
    • 招待講演
  • [学会発表] 血栓性素因の診断と治療2024

    • 著者名/発表者名
      森下 英理子
    • 学会等名
      日本内科学会 第82回東北支部生涯教育講演会
    • 招待講演
  • [学会発表] アンチトロンビンノックアウトゼブラフィッシュの初期胚発生過程における血栓形成2023

    • 著者名/発表者名
      今井 湧太, 野田 太希, 小林 功, 稲津 明広, 森下 英理子, 荒磯 裕平
    • 学会等名
      第85回日本血液学会学術集会
  • [学会発表] Cure of protein C deficiency through neonatal genome editing.2023

    • 著者名/発表者名
      Tomoki Togashi, Nemekhbayar Baatartsogt, Yasumitsu Nagao, Yuji Kashiwakura, Morisada Hayakawa, Nobuhiko Kamoshita, Takafumi Hiramoto, Takayuki Fujiwara, Eriko Morishita, Osamu Nureki, Tsukasa Ohmori.
    • 学会等名
      日本ゲノム編集学会第8回大会
  • [学会発表] Cure of congenital purpura fulminant by neonatal genome editing to express an engineered protein C in mice.2023

    • 著者名/発表者名
      Tomoki Togashi, Nemekhbayar Baatartsogt, Yasumitsu Nagao, Yuji Kashiwakura, Morisada Hayakawa, Nobuhiko Kamoshita, Takafumi Hiramoto, Takayuki Fujiwara, Eriko Morishita, Osamu Nureki, Tsukasa Ohmori.
    • 学会等名
      The 31st Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
    • 国際学会
  • [学会発表] 遺伝性アンチトロンビン欠乏症2症例に同定された新規遺伝子バリアント2023

    • 著者名/発表者名
      松本 陽斗, 長屋 聡美, 目黒 牧子, 今井 湧太, 竹川 清太郎, 築田 怜奈, 西野 優那, 冨樫 朋貴, 大森 健聖, 牧田 友香, 森屋 羽瑠雅, 奥野 隆祐, 堀家 慎一, 森下 英理子.
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
  • [学会発表] 新規に同定されたi型遺伝性アンチトロンビン欠乏症p.Cys32Trpの細胞内動態解析2023

    • 著者名/発表者名
      菊池 結香, 牧田 友香, 長屋 聡美, 今井 湧太, 冨樫 朋貴, 大森 健聖, 安田 芽生, 松本 陽斗, 森屋 羽瑠雅, 目黒 牧子, 堀家 慎一, 森下 英理子
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
  • [学会発表] プロテインC遺伝子における新規バリアントp.Leu173Proおよびp.Val241Leuの細胞内動態の解析2023

    • 著者名/発表者名
      安田 芽生, 長屋 聡美, 大森 健聖, 冨樫 朋貴, 今井 湧太, 森屋 羽瑠雅, 菊池 結香, 牧田 友香, 松本 陽斗, 目黒 牧子, 三浦 晃子, 堀家 慎一, 森下 英理子
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
  • [学会発表] 改変型プロテインCによるプロテインC欠損マウスのゲノム編集治療2023

    • 著者名/発表者名
      冨樫 朋貴, ネメフバヤル・バータルツォグト, 長尾 恭光, 柏倉 裕志, 早川 盛禎, 鴨下 信彦, 平本 貴史, 藤原 隆行, 森下 英理子, 濡木 理, 大森 司
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
  • [学会発表] 出血傾向を呈する異常プロトロンビンSegoviaの機能解析2023

    • 著者名/発表者名
      桑島 大和, 長屋 聡美, 大森 健聖, 今井 湧太, 冨樫 朋貴, 牧田 友香, 松本 陽斗, 森屋 羽瑠雅, 安田 芽生, 菊池 結香, 神窪 勇一, 森下 英理子
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
  • [学会発表] Factor V Kanazawa (Clinical/Lab)2023

    • 著者名/発表者名
      Morishita E
    • 学会等名
      The 31st International Society on Thrombosis and Haemostasis 2023
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Pathophysiological analysis of hereditary thrombophilia - Bedside-to-bench2023

    • 著者名/発表者名
      森下 英理子
    • 学会等名
      第45回日本血栓止血学会学術集会
    • 招待講演

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公開日: 2024-12-25  

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