| 研究課題/領域番号 |
22K07428
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
本井 ゆみ子 順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任教授 (60338407)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | タウ蛋白 / シード依存性凝集 / グリア細胞 |
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| 研究実績の概要 |
疾患特異的シード依存性凝集を利用した血液マーカー開発をめざし、第一段階としてアルツハイマー病(AD)脳シードを用い野生型タウリコンビナントを基質とするreal-time quaking induced conversion assay (RT-QuIC)による定量法実験系の最適化を行った。昨年度までTau基質の濃度を(100μM～5μM)で行っていたが、蛍光度は上昇するが、電顕でタウfilamentが確認できないことから、チオフラビン蛍光の上昇はタウ蛋白がβシート構造を形成し線維化したことを表していないと考えられた。そこで、今回は、ビーズの有無、NaCl, MgCl2などの塩の除去,還元剤変更、バッファー変更、Tau 基質濃度の変更、蛍光度だけでなく電顕観察も併用した。最適条件下では5時間頃より蛍光度が上昇し48時間まで継続、電子顕微鏡で径12.5nmのタウ線維が確認できた。この条件にてアルツハイマー病脳seedを1000倍希釈まで可能であったため、タウ凝集抑制変異Δ368タウを基質としたところ8時間より蛍光度は上昇し、24時間をピークとして低下した。電顕による線維は径20nm以上と太く交叉線維が多く、明らかにヒトADでみられるタウ線維とは異なっており、Δ368タウはADの診断に有用な可能性が示唆された。
疾患特異的シード依存性凝集を利用した薬剤探索についてはアルツハイマー病脳をシードとして野生型タウを過剰発現させた神経芽細胞株に添加し, 48時間培養する系を用いた。不溶性タウを減少させることを指標として700化合物のスクリーニングを行った。最初のスクリーニングで180化合物に絞られ、LDHアッセーにより細胞死をおこすものを除外した。次に可溶性タウを減少させるものも除外し38種に絞られ、最後に3症例の脳をシードとし、最も効果のある薬剤4種類に絞りこみ動物実験を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス初代培養アストロサイトにトランスフェクション試薬を用いてタウを過剰発現させたが、十分な発現が得られず、AD脳シードによる不溶性タウの検出が困難であり、シード活性を計測することができずグリア細胞実験系が確立できないため、実験が遅延している。
ＲT-ＱuiCアッセーはAD脳シードを別患者にしたところシード活性が強くなり、サンプル濃度が濃くなりメッシュの膜がこわれ、電顕写真評価が困難になった。途中でリコンビナントの純度が低下し、蛍光度の上昇がみられなくなることがあり、アッセー系が不安定になっている。
薬剤探索はライブラリーにはいっている化合物が少量であるため同じCAS NO.の他の会社からの化合物を大量に購入し、実験の再現を試みた。神経芽細胞株によるシード活性は変化なかったが、RT-QuiCアッセーによるシード活性が消失していることが判明した。原因として蛋白構造が軽微に変化してしまっていることが考えられた。念のためマウス投与したが、マウスの体重減少がみられ、行動解析が不可能であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
タウ蛋白をトランスフェクション試薬にて過剰発現させることは困難であるため、ウイルスベクターをもちいることとし、当研究室では不可能であるため、共同研究を行うこととした。患者脳のシード保存を-80℃の冷凍庫として10回分を1チューブに分注し、1プレートに2例以上の患者脳を使用し、患者間の差を確認しながら系の最適化を行う。薬剤探索については、シード活性が高い他の化合物を選択し、大量購入し動物実験を開始した。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
国際学会参加を予定していたが、コロナウイルスパンデミックなどにより、参加をとりやめたため、想定より支出が少なかった。次年度はウイルスベクター作成費用、アッセー系のプレート代、抗体購入費用に使用する予定である。
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