高速原子間力顕微鏡を用いた凝集タンパクのクロス・シーディング効果の時空間的観察

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K07514
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 小野 賢二郎 金沢大学, 医学系, 教授 (70377381)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: アルツハイマー病 / レビー小体病 / アミロイドβ蛋白 / αシヌクレイン蛋白 / 高速原子間力顕微鏡

研究実績の概要

アルツハイマー病やレビー小体病（パーキンソン病、レビー小体型認知症）では、アミロイドβ蛋白(amyloid β-protein: Aβ)やαシヌクレイン蛋白(α-synuclein protein: αS)の単独あるいは混合で形成された凝集体が関与している可能性が示唆されている。これまでに我々は、AβあるいはαSの重合核(シード)を用いた凝集反応(セルフ・シーディング)を種々検討している。本研究では、AβとαSとの間での凝集反応(クロス・シーディング)の検討を行い、その凝集促進効果の有無や機序を明らかにすることを目的として研究を展開している。
AβとαSのセルフおよびクロス・シーディングにおいて、各蛋白のシードの調整法がその凝集反応速度に影響を及ぼす可能性が考えられることから、本年度では、まず、種々の方法でAβ42およびαSのシードを調整した。なお、Aβ42は市販のものを用い、αSは大腸菌より調整し精製たものを用いた。得られた各シードを用い、チオフラビンT(thioflavin T: ThT)を利用した系でセルフ・シーディングについて種々検討した結果、調整法により凝集反応に差がみられることを明らかにした。また、Aβ42のセルフ・シーディングについて、高速原子間力顕微鏡(high-speed atomic force microscopy: HS-AFM)を利用した凝集反応の動的観察も検討しており、シードの調整法や測定条件により凝集反応が大きく影響されることを明らかにした。次に、ThTを利用した系でAβ42とαSのクロス・シーディングを種々検討したところ、現在の条件ではクロス・シーディングの凝集促進効果が小さく、HS-AFMで評価可能な時間内で動的観察が困難であることが明らかとなり、シード調整や凝集反応の条件(緩衝液や塩濃度、pHなど)最適化が必要であることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Aβ42やαSのサンプル準備について検討したところ、それぞれのlow molecular weight(LMW)画分(主としてモノマーが存在する画分)とhigh molecular weight(HMW)画分(主としてプロフィブリルなどのオリゴマーが存在する画分)をサイズ排除クロマトグラフィーで効率的に分離することに成功した。得られたAβ42およびαSのLMW画分を用いて、37℃下で静置や振とう、攪拌などの条件で凝集反応を行い、超音波破砕して各シードを調整した。
上記で調整した各シードを用い、セルフ・シーディング(Aβ42シード＋Aβ42-LMW溶液、または、αSシード＋αS-LMW溶液)をThTを利用した系で種々検討したところ、凝集反応の反応速度が速いAβ42あるいはαSシードを見い出すことができた。Aβ42については、HS-AFMでセルフ・シーディングの動的観察を行うことができたが、αSについては現在反応条件を検討している。
次に、Aβ42とαSのクロス・シーディング反応(Aβ42シード＋αS-LMW溶液、または、αSシード＋Aβ42-LMW溶液)を検討した。ThTを利用した系でクロス・シーディングを種々検討したにもかかわらずクロス・シーディングの凝集反応を促進させる条件を見出すことができず、HS-AFMによる凝集反応の評価は検討できていない。この原因については次のように考えている。すなわち、Aβ42については、これまでと同様に市販のものをサイズ排除クロマトグラフィーで分離・精製したLMW画分を用いたが、αSについては、これまでと異なり大腸菌から調整したαSのLMW画分を用いており、このことがクロス・シーディングに大きく影響している可能性を考えている。また、αSシードを調整した際の緩衝液や塩濃度もクロス・シーディングに影響している可能性を考えている。

今後の研究の推進方策

Aβ42やαSの凝集反応（セルフおよびクロス・シーディング）にAβ42やαSのシードが大きく影響していることから、今後は、まず各シードの調整条件(用いる緩衝液や塩濃度、pHなど)について検討する。次いで、ThTを利用した簡便な系でクロス・シーディングの凝集反応が促進される条件を見い出し、HS-AFMによる凝集反応の動的観察を行うことを計画している。その後、Aβ40を用いて同様の実験を行い、Aβ42やAβ40、αS間でのクロス・シーディング効果を検討する。上記の実験がうまく行けば、種々のクロス・シーディングで形成された混合凝集体について、円偏光二色性(circular dichroism: CD)スペクトルで蛋白の2次構造を評価する予定である。

次年度使用額が生じた理由

今年度予定していたαSの凝集の最適条件の検討に時間がかかり、そのため次段階の研究として当初予定していたAβとαSのクロス・シーディングの最適条件の検討にも時間を要したため、次年度使用額が生じた。本研究の基礎となるαSの凝集の最適条件の検討を最優先で行う予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The Curcumin Derivative GT863 Protects Cell Membranes in Cytotoxicity by Aβ Oligomers (2023)
  • 著者名/発表者名: Momma Yutaro、Tsuji Mayumi、Oguchi Tatsunori、Ohashi Hideaki、Nohara Tetsuhito、Ito Naohito、Yamamoto Ken、Nagata Miki、Kimura Atsushi Michael、Nakamura Shiro、Kiuchi Yuji、Ono Kenjiro
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 24 ページ: 3089～3089
  • DOI: 10.3390/ijms24043089
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of Melissa officinalis Extract Containing Rosmarinic Acid on Cognition in Older Adults Without Dementia: A Randomized Controlled Trial (2023)
  • 著者名/発表者名: Noguchi-Shinohara Moeko、Hamaguchi Tsuyoshi、Sakai Kenji、Komatsu Junji、Iwasa Kazuo、Horimoto Mai、Nakamura Hiroyuki、Yamada Masahito、Ono Kenjiro
  • 雑誌名: Journal of Alzheimer's Disease 巻: 91 ページ: 805～814
  • DOI: 10.3233/JAD-220953
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cerebrospinal Fluid Biomarkers and Amyloid-β Elimination from the Brain in Cerebral Amyloid Angiopathy-Related Inflammation (2023)
  • 著者名/発表者名: Sakai Kenji、Noguchi-Shinohara Moeko、Tanaka Hidetomo、Ikeda Tokuhei、Hamaguchi Tsuyoshi、Kakita Akiyoshi、Yamada Masahito、Ono Kenjiro
  • 雑誌名: Journal of Alzheimer's Disease 巻: 91 ページ: 1173～1183
  • DOI: 10.3233/JAD-220838
  • 査読あり
• [雑誌論文] Decreased circulating branched-chain amino acids are associated with development of Alzheimer’s disease in elderly individuals with mild cognitive impairment (2022)
  • 著者名/発表者名: Ikeuchi T, Kanda M, Kitamura H, Morikawa F, Toru S, Nishimura C, Kasuga K, Tokutake T, Takahashi T, Kuroha Y, Miyazawa N, Tanaka S, Utsumi K, Ono K, Yano S, Hamano T, Naruse S, Yajima R, Kawashima N, Kaneko C, Tachibana H, Yano Y, Kato Y, Toue S, Jinzu H, Kitamura A, Yokoyama Y, Kaneko E, Yamakado M, Nagao K.
  • 雑誌名: Frontiers in Nutrition 巻: 9 ページ: 1040476
  • DOI: 10.3389/fnut.2022.1040476
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An exploratory, open-label, randomized, multicenter trial of hachimijiogan for mild Alzheimer’s disease (2022)
  • 著者名/発表者名: Kainuma M, Ouma S, Kawakatsu S, Iritani O, Yamashita KI, Ohara T, Hirano S, Suda S, Hamano T, Hieda S, Yasui M, Yoshiiwa A, Shiota S, Hironishi M, Wada-Isoe K, Sasabayashi D, Yamasaki S, Murata M, Funakoshi K, Hayashi K, Shirafuji N, Sasaki H, Kajimoto Y, Mori Y, Suzuki M, Ito H, Ono K, Tsuboi Y.
  • 雑誌名: Frontiers in Pharmacology 巻: 13 ページ: 991982
  • DOI: 10.3389/fphar.2022.991982
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Interactions of amyloid coaggregates with biomolecules and its relevance to neurodegeneration (2022)
  • 著者名/発表者名: Murakami K, Ono K.
  • 雑誌名: The FASEB Journal 巻: 36 ページ: e22493
  • DOI: 10.1096/fj.202200235R
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Transmission of Cerebral β-Amyloidosis Among Individuals (2022)
  • 著者名/発表者名: Hamaguchi T, Ono K, Yamada M.
  • 雑誌名: Neurochemical Research 巻: 47 ページ: 2469～2477
  • DOI: 10.1007/s11064-022-03566-4
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Combined Treatment with Curcumin and Ferulic Acid Suppressed the Aβ-Induced Neurotoxicity More than Curcumin and Ferulic Acid Alone (2022)
  • 著者名/発表者名: Ohashi H, Tsuji M, Oguchi T, Momma Y, Nohara T, Ito N, Yamamoto K, Nagata M, Kimura AM, Kiuchi Y, Ono K.
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 ページ: 9685～9685
  • DOI: 10.3390/ijms23179685
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-molecule observation of self-propagating amyloid fibrils (2022)
  • 著者名/発表者名: Watanabe-Nakayama T, Ono K.
  • 雑誌名: Microscopy 巻: 71 ページ: 133～141
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfac011
  • 査読あり
• [学会発表] アルツハイマー病の抗体療法とは？ (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経学会学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] アルツハイマー病における疾患修飾療法と脳アミロイドアンギオパチー (2022)
  • 著者名/発表者名: 坂井健二, 山田正仁, 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経学会学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] アルツハイマー病の病態から診断・治療を再考する (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経学会学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] アミロイドβの病態と疾患修飾へのアプローチ (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経学会学術大会
  • 招待講演
• [学会発表] Elimination of vascula Aβ in cerebral amyloid angiopathy-related inflammation/vasculitis (2022)
  • 著者名/発表者名: 坂井健二, 篠原もえ子, 田中英智, 池田篤平, 濵口 毅, 柿田明美, 山田正仁, 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経学会学術大会
• [学会発表] Deterioration after disease modifying treatments in a patient with ATTRv amyloidosis (Leu58Arg) (2022)
  • 著者名/発表者名: 疋島貞雄, 坂井健二, 山口浩輝, 柴田修太郎, 林 幸司, 中野博人, 兼元みずき, 碓井雄大, 谷口 優, 小松潤史, 中村-進藤桂子, 野崎一朗, 浜口 毅, 岩佐和夫, 山田正仁, 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経学会学術大会
• [学会発表] その他の認知症 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 認知症予防学会第6回WEB講演会
  • 招待講演
• [学会発表] 認知症の診断と治療 －アルツハイマー型認知症の治療戦略を中心に－ (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 日本内科学会北陸支部 第86回生涯教育講演会
  • 招待講演
• [学会発表] プロテイノパチーの病因解明 Up to Date (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第63回日本神経病理学会総会学術研究会
  • 招待講演
• [学会発表] Logopenic型進行性失語を呈した Alzheimer病の1例 (2022)
  • 著者名/発表者名: 柴田修太郎, 野崎一朗, 小野賢二郎
  • 学会等名: 第163回日本神経学会東海北陸地方会
• [学会発表] アルツハイマー病の抗体療法の現在 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第12回日本脳血管・認知症学会総会 VAS-COG Japan 2022
  • 招待講演
• [学会発表] ポリフェノール類の認知症への予防・治療効果を考える (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第11回日本認知症予防学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 認知症へのアプローチを考える (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第11回日本認知症予防学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] アルツハイマー病の抗体療法の現状と展望 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第9回日本アミロイドーシス学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 脳アミロイドアンギオパチー関連炎症における脳脊髄液バイオマーカーと血管病理の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 坂井健二, 篠原もえ子, 田中英智, 池田篤平, 濵口 毅, 柿田明美, 山田正仁, 小野賢二郎
  • 学会等名: 第9回日本アミロイドーシス学会学術集会
• [学会発表] Leu58Arg(p.Leu78Arg)変異を有するATTRvアミロイドーシス症例の疾患修飾治療と長期経過についての検討 (2022)
  • 著者名/発表者名: 疋島貞雄, 坂井健二, 赤木明生, 山口浩輝, 柴田修太郎, 林 幸司, 中野博人, 兼元みずき, 碓井雄大, 谷口 優, 小松潤史, 進藤桂子, 野崎一朗, 濵口 毅, 岩佐和夫, 山田正仁, 小野賢二郎
  • 学会等名: 第9回日本アミロイドーシス学会学術集会
• [学会発表] アルツハイマー病に対する疾患修飾療法の現状と展望 (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第40回日本神経治療学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 認知症の診断と治療 －アルツハイマー型認知症を中心に－ (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第40回日本神経治療学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] パーキンソン病の治療的アプローチを考える (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第40回日本神経治療学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] アミロイド仮説から見たアルツハイマー病の病態機序を再考する (2022)
  • 著者名/発表者名: 小野賢二郎
  • 学会等名: 第41回日本認知症学会学術集会／第37回日本老年精神医学会
  • 招待講演