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2022 年度 実施状況報告書

低ホスファターゼ症病態形成新規メカニズム-細胞外リンのシグナル及びATPの関与-

研究課題

研究課題/領域番号 22K07837
研究機関地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所)

研究代表者

山崎 美和 (若林美和)  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 骨発育疾患研究部門, 流動研究員 (50455549)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
キーワードTNSALP / Phosphate
研究実績の概要

組織非特異型アルカリホスファターゼ(TNSALP)は骨芽細胞などの形質膜に存在するectoenzymeであり、ピロリン酸などの基質を分解して無機リン酸を産生する。低ホスファターゼ症 (HPP) はTNSALPをコードするALPL遺伝子の機能喪失に基づき、骨石灰化障害や乳歯早期脱落など多彩な症状を呈するが、病態形成機構は完全には理解されていない。本研究においては、健常人由来iPS細胞にCRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用してALPL-knockout (KO)細胞を樹立し、骨芽細胞系列に分化誘導して解析することにより、HPPの病態形成機構を解明することを目的とした。
健常人由来iPS細胞株にALPLのexon 3とexon 4内の標的配列に対する合成guide RNAとCas9蛋白質を導入し、欠失およびフレームシフトが誘導されたクローンを選定した。ALPL-KOにおいてはTNSALP酵素活性は完全に喪失しており、一方、ALPL-hetero KOにおいてはALPL以外は遺伝的に同質なisogenic controlの半分程度の残存酵素活性を保持していた。リン酸供与体としてbグリセロリン酸を含む骨芽細胞分化誘導培地を用いて8週間まで培養し、経時的にアリザリンレッド染色を行ってin vitro石灰化能を評価したところ、ALPL-KOにおいては培養期間を通じて石灰化が著明に抑制されていた。一方、ALPL-hetero KOにおいては、培養2週目以降、isogenic controlと同等の石灰化を示した。興味深いことに、分化誘導時、ALPL-KO iPS細胞では石灰化の障害にも関わらず、isogenic controlに比しRUNX2やosteopontinの発現が増加していた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

CRISPR/Cas9を適用しALPL欠損ヒトiPS細胞(HPPモデル細胞)を作製した結果、ALPL-KOクローン、ALPL-hetero KOクローンが得られ、骨芽細胞への分化誘導系による性状解析で興味深い結果が得られているため。

今後の研究の推進方策

細胞外リン酸濃度の上昇はFGF受容体のリン酸化やRaf/MEK/ERK経路の活性化を引き起こし、AlplやCyclin D1、Dmp1などのリン酸応答遺伝子の発現を制御する。そこで、HPPモデル細胞及びコントロール細胞を骨芽細胞に分化誘導し、細胞外リン酸濃度の測定、FGF受容体のリン酸化やRaf/MEK/ERK経路の解析、リン酸応答遺伝子の発現の解析を進める。またHPPモデル細胞を筋細胞へと分化誘導し、遺伝子発現や蛋白質発現を検討する。

次年度使用額が生じた理由

当該年度はWEB開催の学会が多かったため旅費の節約が可能となった。次年度は樹立したHPPモデル細胞の筋細胞への分化誘導を予定しており、試薬も高価なためまとまった予算が必要となり、次年度分の請求助成金と合わせて使用する予定である。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2022 その他

すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 1件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Extracellular Phosphate, Inflammation and Cytotoxicity.2022

    • 著者名/発表者名
      Michigami T, Yamazaki M, Razzaque MS.
    • 雑誌名

      Adv Exp Med Biol.

      巻: 1362 ページ: 15-25

    • DOI

      10.1007/978-3-030-91623-7_3.

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Osteocytes and the pathogenesis of hypophosphatemic rickets.2022

    • 著者名/発表者名
      Yamazaki M, Michigami T.
    • 雑誌名

      Front Endocrinol (Lausanne).

      巻: 13 ページ: -

    • DOI

      10.3389/fendo.2022.1005189.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Growth-related skeletal changes and alterations in phosphate metabolism.2022

    • 著者名/発表者名
      Michigami T, Tachikawa K, Yamazaki M, Nakanishi T, Kawai M, Ozono K.
    • 雑誌名

      Bone.

      巻: 161 ページ: -

    • DOI

      10.1016/j.bone.2022.116430.

    • 査読あり
  • [学会発表] 成長に伴うリン代謝変化の細胞分子機序2022

    • 著者名/発表者名
      道上敏美、立川加奈子、山崎美和、中西達郎、川井正信、大薗恵一
    • 学会等名
      第55回日本小児内分泌学会学術総会
  • [学会発表] Growth-related Skeletal Changes and Alterations in Phosphate Metabolism from Youth to Adulthood2022

    • 著者名/発表者名
      Toshimi Michigami, Kanako Tachikawa, Miwa Yamazaki, Tatsuro Nakanishi, Masanobu Kawai, Keiichi Ozono
    • 学会等名
      ASBMR 2022 Annual Meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] CRISPR/Cas9によるPHEX欠損ヒトiPS細胞の樹立および解析2022

    • 著者名/発表者名
      中西達郎、山崎美和、立川加奈子、川井正信、大薗恵一、道上敏美
    • 学会等名
      第40回日本骨代謝学会学術集会
  • [学会発表] 成長に伴う骨成熟はFGF23-Bone-Kidney axisのシフトをもたらす2022

    • 著者名/発表者名
      道上敏美、立川加奈子、山﨑美和、中西達郎、川井正信、大薗恵一
    • 学会等名
      第95回日本内分泌学会学術総会
  • [学会発表] 骨芽細胞におけるIII型ナトリウム/リン酸共輸送担体の欠損は骨形成関連遺伝子の発現減少にもかかわらず石灰化の亢進を示す2022

    • 著者名/発表者名
      山﨑美和、川井正信、木下さおり、立川加奈子、中西達郎、大薗恵一、道上敏美
    • 学会等名
      第95回日本内分泌学会学術総会
  • [備考] 骨格形成等についての研究内容|大阪母子医療センター

    • URL

      https://www.wch.opho.jp/research/bone/content.html

  • [備考] 研究業績(骨発育疾患研究部門)|大阪母子医療センター

    • URL

      https://www.wch.opho.jp/research/bone/work.html

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公開日: 2023-12-25  

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