| 研究課題/領域番号 |
22K07852
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
三谷 幸之介 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10270901)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | プライム編集 / ゲノム編集 / アデノウイルスベクター / iPS 細胞 |
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| 研究実績の概要 |
アデノウイルスベクターによる高効率なprime editing（PE）を達成する上で、PE4（PE2の改良型）遺伝子と変異Venus遺伝子を標的とするepegRNA（pegRNAの改良型）との比を調節可能にするために、敢えて別々のベクターとして構築した。
PE4発現ベクターが増殖しにくいという問題が生じたが、PE4遺伝子のORFに変異を入れたベクターは増殖するため、PE4遺伝子の116細胞での発現が何らかの問題である。そこで、1) PE4遺伝子の3’非翻訳領域に293細胞（116細胞の親細胞株）での発現を抑制するmiR183/218を4コピーずつ挿入し、2) PE4遺伝子のプロモーターをCMVからそれよりも弱いEF1αへと置き換えた。その結果、PE4ベクターもVenus-epegRNAも高力価（1.7 x 10E10/mlと4.2 x 10E10/ml）で増殖させることが出来た。
これらベクターは、先ずAd5血清型のヘルパーウイルスで調整した。ベクターの感染によるPEの効率を測定するために、A549、HepG2、Hep3B、ヒトiPS細胞に対して、変異Venus遺伝子が染色体に組み込まれた細胞をそれぞれ樹立した。
感染実験の結果、A549ではMOI 300（細胞あたりの感染粒子）で94%、HepG2ではMOI 30で92%、Hep3BではMOI 100で51%、ヒトiPS細胞ではMOI 30で30%と、これまでの報告を大きく上回る高効率でPEが得られた。
しかしながら、CAG-Venusベクターを用いた感染と比較すると、遺伝子導入された細胞の1/3~1/2 でのみPEが達成されていた。最近、HDAC6 阻害剤の処理で293T細胞におけるPEの効率が最高2.3倍上昇することが報告された。そこで、私達もHDAC6阻害剤処理を試みたが、更なる効率の上昇は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
改良型として、PE4遺伝子発現とepegRNA発現のベクターを別途構築した。また、PE4遺伝子発現ベクターの産生上の問題を克服するため、デザインを工夫した新たなベクターを構築し、高力価で調整した。
それらのベクターを用いて様々な細胞でPE実験を行った。K562細胞ではまだ実験は行っていないが、A549細胞やHepG2細胞で、目的の90%を越える効率でのPEに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度はAd5血清型のベクターを調整したが、造血細胞にも感染できるようにAd35血清型のヘルパーウイルスでベクターを調整する。
K562細胞とヒトCD34陽性造血幹前駆細胞を標的として、先ず変異Venusを標的としたPEを行う。それに引き続き、治療標的遺伝子であるIL2RG遺伝子座のexon2を修復するprime editingを行う。
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