| 研究課題/領域番号 |
22K08101
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
小垣 滋豊 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00311754)
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| 研究分担者 |
石田 秀和 大阪大学, 大学院医学系研究科, 講師 (50467552)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 拘束型心筋症 / 心筋線維芽細胞 / iPS細胞 |
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| 研究実績の概要 |
当院にて心臓移植を受けた小児拘束型心筋症患者の血液細胞から、山中4因子を発現するセンダイウイルスベクターを用いることで、iPS細胞株を樹立した。このiPS細胞株は、患者と同様、トロポニンＩ遺伝子にミスセンス変異を有しており、この変異はこれまでの既報やClinvarにおいても、pathogenicとされているバリアントである。また、正常核型を維持していること、3胚葉への分化能を維持していることを確認した。次に、このiPS細胞株を心筋細胞へと分化誘導したところ、95%以上の高率で心筋細胞へと分化誘導可能であった。
さらに、このiPS細胞株に対して、CRISPR/Cas9システムを用いることで、トロポニンＩの変異を修復したiPS細胞株（Isogenic corrected line)と、ホモ接合体にした株（Homo line)を作成した。すべてのiPS細胞株は同様に心筋細胞への良好な分化誘導が可能であった。
これらの細胞株を用いて、心筋細胞へと分化誘導したのちに、健常の心筋線維芽細胞と共培養を行った。これはインサートを用いたindirect co-cultrue系で行った。48時間の共培養の後、心筋線維芽細胞のRNA-seqを行ったところ、ヘテロ接合体である患者iPS細胞由来心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞は、その発現パターンが、isogenic corrected iPS細胞由来心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞や、共培養を行っていない線維芽細胞と比較して、かなり異なっており、またこの差異はHomo -iPS由来の心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞ではより顕著であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
RCM-iPS細胞の樹立および、isogenic lineの構築、またそれらの心筋細胞への分化誘導は大変効率よく行うことが出来ている。また、共培養実験についても順調に行っており、RCM-iPSC由来心筋細胞や、ホモ接合体に遺伝子改変したiPS細胞由来心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞では、網羅的遺伝子発現プロファイルが有意に変化することを示すことが出来ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
RCM-iPS細胞由来の心筋細胞や、CRISPR/Cas9によって遺伝子改変を行い、トロポニンＩ変異を修復したisogenic lineや、ホモ接合体にしたlineを由来とする心筋細胞を、健常の心筋線維芽細胞と共培養を行い、RCM-iPS細胞由来心筋細胞と共培養した心筋線維芽細胞はその遺伝子発現プロファイルが変化していることが確認できている。次には、これら発現パターンが変容した心筋線維芽細胞を、逆に健常iPS細胞由来の心筋細胞と共培養することで、健常心筋細胞の収縮能や拡張能が変化するかどうかを検証する。これにより、心筋細胞と心筋線維芽細胞の相互作用が、双方向性であるのかどうかを検証する。
また、これまでの我々の研究により同定されている、心筋線維芽細胞の拡張能を悪化させうる液性因子について、これらの阻害薬あるいはリコンビナントタンパクを培地に添加することで、心筋細胞の拡張能が改善するかどうかについての実験を行い、具体的にどのシグナル経路、どの分子が、心筋細胞の拡張能増悪に大きく寄与しているのかを明らかにする。
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