| 研究課題/領域番号 |
22K08249
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| 研究機関 | 公益財団法人結核予防会 結核研究所 |
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研究代表者 |
宮林 亜希子 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 生体防御部 病理科, 研究員 (40834726)
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| 研究分担者 |
慶長 直人 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 副所長, 副所長 (80332386)
土方 美奈子 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 生体防御部, 部長 (90332387)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | エストロゲン / 気道上皮 / エピジェネティック |
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| 研究実績の概要 |
非結核性抗酸菌症、特に肺のMycobacterium avium complex感染症 (肺MAC症) は近年わが国の結核罹患率を上回っており、また、多剤併用による２年以上の治療によっても難治で、環境中の弱毒菌である抗酸菌が感受性のある中高年女性に定着して慢性気道炎症を起こす宿主側の分子メカニズムの解明が求められている。
本研究では、環境中の抗酸菌が、感受性のある中高年女性に定着して肺MAC症となる宿主側の分子メカニズムに、エピジェネティック修飾による遺伝子発現の変化が関わることを考え、肺MAC症患者群及び対照群より得られた気道上皮細胞 (手術検体) を材料としてゲノムワイドエピゲノム解析 (DNAメチル化解析) を行い、次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析とあわせ、肺MAC症の背景にある気道粘膜の免疫・炎症応答性、粘膜防御能の脆弱性に関わる遺伝子を明らかにすることを目指す。
昨年度実施した培養ヒト気道上皮細胞のゲノムワイドDNAメチル化解析に引き続き、本年度は同検体での網羅遺伝子発現解析によって症例群と対照群の比較で発現差のある遺伝子 differentially expressed genes (DEGs) と候補メチル化領域 differentially methylated regions (DMRs)を合わせた解析を行い、疾患群に特徴的なエピジェネティック修飾を受けて遺伝子発現が変動している候補遺伝子を探索した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
肺MAC症（症例）群、非慢性気道感染症（対照）群 (各群4例)の培養ヒト気道上皮細胞から抽出された全RNAを材料とした。メチル化領域とRNA発現の関連をより幅広く探索するため、ポリA選択を行うmRNA-seq法ではなく、リボソームRNAの除去を用いるtotal RNA-seq法を選択したのに伴い、抽出した全RNAにDNase処理を追加されたものを用いている。TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold (Illumina)により作成されたライブラリーを、NextSeq 500（Illuminaでシークエンスを行い、取得された配列データを解析に用いた。トリム後にヒト参照配列 (GRCh38) へのマッピングと遺伝子発現量のカウント、発現差解析を行った。
ゲノムワイドDNAメチル化解析および網羅遺伝子発現解析での症例群と対照群の比較で、遺伝子発現に影響する候補メチル化領域differentially methylated regions (DMRs) を探索を行った。疾患に特徴的な候補遺伝子についての検討を実施中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
網羅遺伝子発現解析によって症例群と対照群の比較で発現差のある遺伝子differentially expressed genes (DEGs) と、ゲノムワイドDNAメチル化解析の結果と合わせた解析を行い、疾患群に特徴的なエピジェネティック修飾を受けている候補遺伝子を抽出する。
気道上皮細胞パネル(約120検体) を用い、バイサルファイト処理と次世代シークエンサーによるターゲット領域のシークエンスを組み合わせたDNAメチル化解析とリアルタイムRT-PCRによる候補遺伝子のmRNA発現解析を行うことで、候補メチル化領域と候補遺伝子の絞り込みを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
症例群と対照群の比較で発現差のある遺伝子differentially expressed genes (DEGs) を追加解析するための費用としてRNA-seqが計上してあったが、初回のシークエンスで本研究の解析に十分なデータ量が得られていたために今年度は追加解析を実施しなかった。
ゲノムワイドDNAメチル化解析と遺伝子発現解析の結果を検討したうえで、次年度においてRNA-seqの解析を再確認する必要がある場合に使用し、追加のRNA-seqが必要ないと判断された場合は、気道上皮パネルの候補領域のバイサルファイトシークエンスと遺伝子発現解析のデータ取得量を増加させることに用いる。
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