| 研究課題/領域番号 |
22K08437
|
|---|
| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
|---|
研究代表者 |
村上 孝 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (00326852)
|
|---|
| 研究分担者 |
今井 孝 埼玉医科大学, 医学部, 非常勤講師 (10513434)
堀内 大 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30608906)
中村 彰宏 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (50750973)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| キーワード | 腫瘍免疫 / メラノーマ / 分子標的 |
|---|
| 研究実績の概要 |
進行性悪性黒色腫（メラノーマ）の治療抵抗性の最大の要因は、その腫瘍内微小環境における著しい免疫応答性の低さにある。その腫瘍免疫原性を再プログラム化して治療奏効性を劇的に改善させる方法として、我々はサルモネラ菌のメラノーマ細胞内感染による細胞変性が腫瘍免疫原性を亢進する性質を明らかにしている。本研究では、この分子論的な仕組みを明らかにし、腫瘍免疫原性再編のスイッチ分子を求めるものである。当該年度では、分子標的を絞り込むため、CRISPR/Cas9ゲノム編集による機能的ゲノム・スクリーニングを実施した。まずCas9発現SK-MEL-28（SK-MEL-28-Cas9）メラノーマ細胞に約19,000遺伝子に対するsgRNA(4種類/遺伝子)を発現するレンチウイルスベクターを感染した細胞株ライブラリーを作製した。1次スクリーニングとして赤色蛍光タンパク質tdTomatoで標識したサルモネラ菌株を作製したライブラリー細胞内感染させ、細胞変性を回避して生き残った細胞を回収した。生存細胞を用いて同様にサルモネラ菌の細胞内感染を実施し、さらに2次スクリーニングを行った。これら2次スクリーニングの生存SK-MEL-28-Cas9細胞からゲノムDNAを抽出し、生存細胞で濃縮されているsgRNA配列情報を次世代シークエンサー(NGS)解析によって遺伝子抽出を行った。非スクリーニング群と比較して2セット実験群を解析し、NGSリード数が共通して多い遺伝子リストを作製した。これらのうち上位リストは標的スイッチ遺伝子候補となりうることから、それぞれの標的遺伝子破壊を順次進め、機能分子群の絞り込みを進めたい。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
約19,000遺伝子に対するsgRNAライブラリーのうち、バイオインフォマティクス上のNCBI遺伝子ID登録における不具合が存在した（92の遺伝子名のうち、名前を得ることができなかったものがあった）。それらNCBI遺伝子IDの取得と問題解消に3ヶ月を要した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
NGS解析情報の主要分子を中心にSK-MEL-28-Cas9細胞およびB16-Cas9細胞の標的遺伝子破壊を順次進め、実際に細胞変性を回避する機能分子群を絞り込む。またヒト・マウス細胞に共通した細胞変性回避から種を超えて保存された分子機構の割り出しにも配慮したい。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
sgRNAライブラリーにおけるバイオインフォマティクス上のNCBI遺伝子ID登録における不具合から候補遺伝子の割り出しに遅れが生じたことから標的遺伝子のsgRNA合成とその発現ベクター構築に遅れがでたため、未使用経費が生じた。次年度ではバイオインフォマティクスの観点から候補遺伝子機能を類推しながら、優先すべき候補遺伝子のsgRNAベクター構築を順次進め、経費を執行していく。
|
