• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2023 年度 実施状況報告書

iPS細胞由来巨核球が産生する血小板を活用したヒトCLEC-2の機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 22K08499
研究機関山梨大学

研究代表者

大石 沙織  山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50894094)

研究分担者 井上 克枝  山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10324211)
築地 長治  山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (20710362)
佐々木 知幸  山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (40739124)
白井 俊光  山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50710381)
研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
キーワード血小板 / CLEC-2
研究実績の概要

imMKCLに対するゲノム編集について情報収集を行ったところ、imMKCLに直接ゲノム編集を施すと血小板産生量が低下するため、iPS細胞へのゲノム編集が望ましいということが分かった。そこで、京都大学iPS研究所より、imMKCLからre-reprogrammingされたMK-iPS細胞を譲渡していただき、ゲノム編集を行う方針とした。
CRISPR-Cas9によりCLEC1B遺伝子をノックアウトするにあたって、適切なgRNA標的部位を推定するため、予備検討を行った。Full length、exon3を欠失、exon3-4を欠失させたCLEC1Bの発現ベクターを作製しHEK293細胞で発現させたところ、完全に細胞外への表出をなくすにはexon3-4を欠失させるのが望ましいことが判明した。そこで、exon3およびexon4にgRNA標的配列を設定することとした。
gRNA標的配列の候補を複数設定しgRNAを合成した。各gRNAのゲノム編集効率を評価するため、個別にMK-iPS細胞にトランスフェクションし、バルクでのゲノム編集効率解析を行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

初年度に、別のプロジェクトを早急に行う必要性が生じ、本プロジェクトへの着手が予定よりも遅れたこと、またこれまでに使用経験のない新規の細胞を導入することになったため、予定よりも進捗が遅れている。

今後の研究の推進方策

現在、単一のgRNAを用いてゲノム編集を行い、バルクでの編集効率解析を実施している。今後は最適なgRNAの組み合わせを決定した上で、複数gRNAでのゲノム編集、サブクローニング、コロニー培養、ゲノム回収の上、株ごとの配列確認に進む予定である。CLEC1BKO MK-iPSが得られた後には、京都大学iPS研究所にimMKCLへの分化培養を依頼する。CLEC1BKO imMKCLより血小板を得て、機能解析に進む。

URL: 

公開日: 2024-12-25  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi