| 研究課題/領域番号 |
22K08689
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
福光 剣 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (70700516)
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| 研究分担者 |
小木曾 聡 京都大学, 医学研究科, 助教 (10804734)
石井 隆道 京都大学, 医学研究科, 講師 (70456789)
波多野 悦朗 京都大学, 医学研究科, 教授 (80359801)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | a |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、胆汁のドレナージシステムを３Dで再構築することを目的としている。これまで我々の研究室では生体由来の３次元スキャフォールドを鋳型として様々な細胞を生着させることでbio-engineered liverを作製することを試みてきた。これまで、肝細胞機能については多くの報告があるが、胆汁産生とそのドレナージについてはまだ報告がない。我々はliver ductal organoidを用いることで、胆管をほぼ無限に増殖させ、かつ３次元スキャフォールドの鋳型の中で、３次元構造を構築することを報告したが、今回はこのliver ductal organoidによる胆管構造と肝細胞との共培養にて、３次元の胆汁産生およびドレナージシステムの構築を試みている。まず、肝細胞が産生した胆汁が培養液中に無秩序に流れ出ることを予防するために、肝臓の被膜にコーティングを施し、培養液、血液、産生された胆汁の漏出を防止することとした。次に、胆管と肝細胞の立体的な構造を明瞭に視認できるようにするために、胆管上皮細胞と、肝細胞が構成する細胆管が特異的に発現するマーカーを用いて免疫染色を行い、それを共焦点顕微鏡にて立体的な画像として捉えた。３次元スキャフォールド内で肝細胞による細胆管構造が網の目状に再構築され、それに隣接するように胆管上皮細胞による胆管構造が存在することを示した。これらの技術改良をそれぞれ組み合わせて、肝細胞が産生した胆汁をドレナージする仕組みを再構築したbio-engineered liverに向けて一つ一つずつ課題を解決していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まず、脱細胞化肝臓組織に培養液を還流させた際に、肝表面から還流液が漏出する問題を解決するために、生体ラットから肝臓を摘出した後にPFAにて固定してから界面活性剤を還流することを試みた。作成した3次元脱細胞化スキャフォールドに色素を含んだ還流液にて評価したところ、表面からの色素の漏出は改善していることを確認した。次に、脱細胞化した３次元スキャフォールドに初代培養肝細胞を生着させたのち、胆管から排出される溶液を収集して溶液中の胆汁酸を測定したところ、培養液中の胆汁酸と比較して高濃度であることを確認した。まだ実施回数が少ないため、今後は再現性の確認を行う必要がある。また、肝細胞で産生された胆汁が胆管へ導出されるためには、再胆管と胆管とが接続したドレナージ構造を再構築する必要があるが、まずその構造を評価するための仕組みを構築した。コントロールとして生体肝臓において、胆管をCK19、再胆管をMRP2にて免疫染色を行い、共焦点顕微鏡にて立体構造を再構築した。また、これらの実験と並行して、細胞を生着させたのちのbio-engineered liverを生体内へ移植して血液を環流する際に、血栓を形成して血液が環流できない問題がある。我々は、抗血栓形成作用を有する新規ポリマーを作製し、その効果について評価を行っている。In vitroにおいて血液を環流すると、ポリマーコーティングされたスキャフォールドでは血栓の形成は抑制され、血液還流がスムーズに行われることを示した。
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| 今後の研究の推進方策 |
脱細胞化した3次元スキャフォールドに肝細胞を生着させて培養液を循環させ、胆管より排泄される排液を解析したところ、総胆汁酸の濃度が環流させている培養液の胆汁酸濃度よりも高値であることを示したが、実験系が複雑であることなどにより安定して再現することが難しい。そこで、胆汁より排泄される液の回収方法を変更するなどして、効率よくかつ再現性高くなるような工夫を繰り返している。また、再胆管構造と胆管構想とが接続する構造を脱細胞化した3次元スキャフォールドを鋳型として再構築することを試みているが、それぞれCK19とMRP2で免疫染色し共焦点顕微鏡にて立体構造として再現する。次に、脱細胞化した3次元スキャフォールドを鋳型として胆汁ドレナージシステムを再構築するだけでなく、in vitroにおいて成熟肝細胞とliver ductal organoidをスフェロイド共培養することで、micro liverのような構造を構築させ、胆管構造を再現することを試みる。
それとともに、抗血栓作用をもつポリマーを作製しているが、in vitroの実験では抗血栓形成作用を確認できている。そこで、本年は生体ラットの動静脈を環流することでin vivoにおいても抗血栓形成作用を有するかを評価する。本ポリマーでコーティングすることで、血液還流をスムーズに行うことができるようになることが期待される。本ポリマーの新規作成については、今年度中に論文として投稿できるよう準備を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
残金として1099円残ることとなったが、物品購入の際の端数に近い金額であると考えており、これらを翌年度に繰り越すことで効率的に資金を活用することが可能となる。
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