| 研究課題/領域番号 |
22K09186
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
川井 廉之 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (90445073)
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| 研究分担者 |
中山 章文 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 教授 (70536721)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 敗血症 / 迅速診断 / 16SrRNA / PCR |
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| 研究実績の概要 |
敗血症の原因菌の同定には現在の検出方法では迅速性に欠ける。現在の実用化されている検出方法では、細菌の増殖能に依存した培養による前処理が必要であることがある。さらに敗血症症例から得られた血液サンプルから迅速に原因菌を分子生物学的アプローチによって同定できない理由の一つは原因菌のDNA量と比較して、圧倒的多数存在するヒト遺伝子由来のDNAに対する非特異的反応があげられる。
本研究の目的は、これらの課題を解決し、敗血症患者からえら得た血液サンプルから迅速に原因菌するために、培養による増菌の過程を経ずに、直接原因菌の遺伝子を増幅する手法の確立を行うことである。
我々はこれまでの研究で、ヒトDNAとの非特異的増幅を排除しながら微量に含まれる細菌DNAの増幅が可能となるPCR条件を開発し、特定の細菌に対しては極めて微量のDNAであっても非特異的増幅を排除した細菌DNAの増幅を確認した。一方、この実験条件では一部の細菌DNAに対する増幅効率には課題が見いだされた。そこで、敗血症治療において臨床上問題となる原因菌を広く同定することが可能となるように、in silicoの実験で増幅効率が不良な菌種のDNA配列の確認と改善を進めてきた。現在、多様な細菌に対して効率よく増幅可能なプライマーの候補に対して、ヒトDNAとの非特異的増幅の排除が可能となるように、個々の実験条件のチューニングと検証を進めている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
増幅効率を高めることで、新たに試薬中の極めて微量のDNAとの非特異的反応が問題となった。これに対しては、PCR反応開始前に試薬中のDNAを分解することによって、解決出来る見込みである。
さらに、すでに開発済みのプライマーをin silicoの実験でより広い範囲の細菌DNA配列に対応可能となるように見直しを進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
すでに開発済みのプライマーをin silicoの実験で臨床上課題となる、より多様な細菌DNAを効率よく増幅できるよう改善する。
上記プライマーの開発によって、ヒトDNAとの非特異的反応の排除を確認する。
実験的にヒトDNAと細菌DNAの混合検体で、細菌DNAを特異的に効率よく増幅できることを確認する。
敗血症臨床血液検体から、細菌DNAの増幅とシーケンス解析による細菌同定によって同定された細菌種と血液培養検査で同定された菌種との比較検証を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験系の見直しによって従来の試薬に加えて精度向上のために利用が必要となったプローベが代替品では条件を満たさず新規購入となったため支出が増加した。
また、複数の細菌に対する感度実験を行うためには細菌DNAの入手が必要である。しかし、極めて複数におよぶ細菌DNAを個々に入手することは現実的ではなく、費用も極めて高額となる。このため、多様な菌種に対してin silicoでの実験を行うことで、増幅困難な菌種の同定を行うこととした。高速で多様な菌種の解析を行うため、一部の計算において外部機能を使用する必要があり、追加の費用が発生した。
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