| 研究課題/領域番号 |
22K09254
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
荒木 芳生 名古屋大学, 医学系研究科, 客員研究者 (80467290)
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| 研究分担者 |
金森 史哲 名古屋大学, 医学系研究科, 特任助教 (00905979)
大岡 史治 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (10725724)
横山 欣也 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (90867904)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | もやもや病 / 次世代シークエンシング / 蛋白発現解析 |
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| 研究実績の概要 |
もやもや病好発年齢、進行期である20歳以下の患者検体は、中高年以降の患者と比較して病変部動脈壁の菲薄化がさらに進行しており、western blotを行う上で十分量の蛋白が得られないと判断した。そこで2022年度は次世代シークエンシングを用いて、20歳未満の患者群、対照群についてトランスクリプトームを行うことで、病変部におけるCOL12A1の発現について検索を行うこととした。20歳以下のもやもや病患者を疾患群、焦点切除術を受けた難治性てんかん患者を対照群とした。脳表の動脈壁からtotal RNAを抽出し、NGSによるRNA-Seqを行った。データのマッピングと標準化ののち2群比較を行った。q-value＜0.05かつ｜Log2 fold change｜＞2のものをdifferentially expressed gene(DEG)とした。もやもや病10例、てんかん5例の比較に対しアッセイを行った。男女比と年齢分布は両群で一致させた。対照と比較し、もやもや病群では42遺伝子が高発現、144遺伝子が低発現、合計166遺伝子がDEGとなったが、CAL12A1はこれに含まれなかった。DEGsに対するエンリッチメント解析ではマトリソーム、細胞接着、血管新生に関連する遺伝子セットが有意に多く見られた。しかしながら特にもやもや病群において、次世代シークエンシングにおいてマッピング率が50%を下回るなど極端に低い値となっていた。開始total RNA量が微量であることが想定された。現在はこれまでのプロトコールよりもさらに微量の開始toral RNA量からライブラリ作成が可能なsingle cellを対象としたＮＧＳライブラリ作成キットを用いたプロトコールを作成中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
特にもやもや病患者の病変部検体に含まれる蛋白やtotal RNA量が想定よりも微量であったことが原因と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在はこれまでのプロトコールよりもさらに微量の開始toral RNA量からライブラリ作成が可能なsingle cellを対象としたＮＧＳライブラリ作成キットを用いたプロトコールを作成中である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次世代シークエンシングについて、途中解析にてライブラリのマッピング率の低さからプロトコールの変更が必要となったことにより、当初の実験計画よりも進行が遅れたため。
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