| 研究課題/領域番号 |
22K09604
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
西尾 浩 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90445239)
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| 研究分担者 |
岩田 卓 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (30296652)
加藤 侑希 日本大学, 医学部, 助教 (60733649)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 卵巣がん / がん免疫療法 / 免疫寛容 / がん微小環境 |
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| 研究実績の概要 |
1.anergyを規定するFR4/CD73発現解析
FR4/CD73の発現を認める免疫細胞を同定するためにC57BL6健常マウスより末梢リンパ節・脾臓組織を摘出し，各細胞分画をFACS AriaIIによりsortingし，qPCRおよびwestern blot法にてNrn1の発現を解析した．結果：FR4/CD73はTreg(CD4+CD25+FoxP3+)で発現が他の細胞分画と比較し，最も上昇していた．すなわちFR4/CD73は免疫細胞の中でも特にTreg細胞およびanergic T細胞において特異的に発現する分子と考えられた．
同様の検討を健常人の末梢血を用いて行った．ヒトでも同様にCD4+FoxP3+の細胞分画で発現が上昇し，特に活性化TregとされるCD44highCD62Llowのpopulationで発現が上昇していることが判明した．一方，naiveCD4, naiveCD8, Bcell, NKcell, 抗原提示細胞での発現は認めなかった．
2. 腫瘍浸潤T細胞におけるFR4/CD73の発現解析
マウス由来の癌細胞を皮下移植した各種モデルマウスを用いて，がん微小環境でのFR4/CD73の発現を解析した．melanoma細胞株であるB16F10細胞を皮下移植し，十分に腫瘍が大きくなったことを確認し，腫瘍および血液中のCD4+細胞，Treg細胞(CD25+細胞)をFACS AriaIIを用いてsortingし，qPCRによりmouse FR4/CD73の発現を検討した．結果：腫瘍浸潤Tregで最も発現が亢進していた．以上の結果よりFR4/CD73はTreg細胞，特に腫瘍に浸潤するTregにおいて特異的に発現を認める分子であることが判明した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度はFR4/CD73の発現解析を中心に研究を遂行した．当初Treg細胞群での発現が予想されていたが，本検討ではanergy populationでの発現も認めた．すなわちFR4/CD73は単にTreg細胞に特異的に発現している分子ではなく，CD4T細胞が抗原に対して反応しなくなった状態においても発現している点は，非常に新しい知見を得たと言える．また腫瘍モデルマウスにおいて腫瘍に浸潤するTregにおいても発現が上昇することが確認され，本分子が癌免疫療法の治療ターゲットとなりうることが示された．以上の結果を鑑みるに，初年度の進捗状況は予定通り順調といえる．
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| 今後の研究の推進方策 |
1. RNA SequencingによるFR4/CD73関連分子と関連するpathwayの同定
FR4conditionalノックアウト(KO)マウスとワイルドタイプ(WT)マウスを用いて，それぞれのリンパ節と脾臓組織からCD4T細胞をFACS AriaIIによりsortingを行い，CD3の刺激を加えたのちRNAを抽出する (サンプルは最低3検体ずつ使用する)．続いて次世代sequencerを用いて遺伝子発現の違いを網羅的に解析する．具体的にはRNA sequenceより得られるFPKM値を用い，一定の発現量を認める遺伝子群においてKOと比較してWTで統計学的に優位な変化を認める遺伝子発現リストを作成する．このリストを用いて以下のbioinformatics解析を行う．
2. 腫瘍モデルマウスでのT細胞誘導増強法の検討
In vivo腫瘍モデルマウスの検討ではヒト卵巣がんの癌微小環境を反映するマウス細胞株(ID8)を用いる．このマウスを用いて，さらに内在性腫瘍抗原特異的な免疫を誘導し，抗FR4体，抗CD73抗体の生体内でのがん細胞死を誘導できる分子標的薬や化学療法剤などの薬剤，T細胞活性化抗体(抗CTLA-4抗体や抗PD-1抗体)を用いて内在性腫瘍抗原に対するT細胞機能促進方法を検討する．さらにヒト卵巣がん検体特に腹水を用いてヒト癌細胞を移植した免疫不全マウスに各種ヒト免疫細胞や間質細胞を移入して，ヒト癌細胞によるヒト免疫系への作用を解析する系(ヒト化マウス)を樹立する．これらの腫瘍モデルマウスを用い，抗CD73抗体および抗FR4抗体療法の効果を検討する．
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