ヒト臍帯由来間質細胞のエピゲノム解析による特性解明と骨再生医療に向けた基盤研究

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K10212
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 金澤 三四朗 東京大学, 医学部附属病院, 客員研究員 (60823466)
• 研究分担者: 岡田 寛之 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (10883481) ; 井上 登紀子 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (70240736) ; 北條 宏徳 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (80788422)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 口唇口蓋裂 / 臍帯組織 / 一細胞解析

研究実績の概要

現在、口唇口蓋裂（CL/P）など先天性顔面顎・顔面骨の欠損に対して、組織幹細胞を用いた骨再生医療研究が進められているが、欠損領域の特殊性や細胞単離時の異種性、あるいは培養による特性低下など高いハードルにより難渋している。これらは単離細胞の実態が不明確なため、進捗の阻害要因となっている、と考えた。近年、臍帯（UC）からもBM由来と機能特性や免疫学的に類似するMSCs（UC-MSCs）が存在することが報告されている。またUC-MSCsは、細胞の調達、保管、および移植において、他の幹細胞源よりも有用であるとされている。しかし、UC-MSCsの遺伝子プロファイルやMSCsを構成する細胞集団の機能的特性や分化指向性については未だに解明されていない。したがって、本年度は分担研究者の長村准教授よりCL/P患者由来細胞を供与されたことから、まず健常由来とCL/P由来UCの一細胞解析（scRNA-seq）による特性比較から、CL/P発症および病態メカニズムの解析を行った。具体的には、それぞれの細胞をscRNA-seqにより集団の特性変化を検索した。フィルタリング後のCL/P群、対照群で各4429および3653細胞を回収し、それぞれ35502および35171遺伝子を対象として解析を行い、遺伝子発現プロファイルを基に10細胞集団を特定した。さらに、両群を統合させることにより生じた違いを確認した。次に、Seuratを用いて各集団のDEG上位10から機能的背景を割り出し、また、特定した細胞集団の動態変化、trajectoryの描出による集団の分化プロセス、GO analysisで集団の機能的特性を解析した。その結果、CL/P群は2つの集団で遺伝子発現に有意な差を認めたことから、CL/P由来組織が健常組織と比較して、遺伝学的に特性が異なることを示唆した。次年度はカギとなる細胞の特定を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の目的は、BM-MSPCsに見られる特性と同等あるいは類する骨分化指向性を有するUC-MSCの細胞間シグナルを解明し、シグナルを活用した培養法を確立し、骨再生医療の新たな治療法としての有効性を立証することである。そのため、当初本年度は以下の研究を実施予定であった。１、ヒト臍帯組織に存在するniche構成間葉系細胞集団の特定。２、特定間葉系細胞集団における遺伝学的特性解析と分化指向シグナルの同定。
１、組織工学の発展により再生医療発展を加速しているが、顎顔面領域などの複雑な骨の機能的再構築はいまだ骨組織工学における重要な課題である。一方で、CL/P発生における遺伝子発現調節メカニズムを解明することも急務となる。本年度、臍帯が胎児と母体に共通した特性を有する唯一の組織であることに着眼し、発生過程で生じる特性変化を捕捉可能であると考え申請者は、単離培養した臍帯細胞（CL/P由来および健常）をscRNA-seq解析を行い、フィルタリング後のCL/P群、対照群で各4429および3653細胞を回収し、それぞれ35502および35171遺伝子を対象として解析を行い、遺伝子発現プロファイルを基に10細胞集団を特定した。
２、1項にて特定した10細胞集団の遺伝子発現プロファイルからSeuratを用いたnormalization, dimensionality reduction, clusteringを行うことで、特定した両細胞集団の動態変化、trajectory（pseudotime analysis）の描出による集団の分化プロセス、GO analysisなどのgene-based analysisで集団の機能的特性を明らかにした。この両群のscRNA-seqデータを基に統合解析をおこなったところ、ある集団で明らかな発現差を認めた。現在、細胞種の特定を進めている。

今後の研究の推進方策

次年度研究計画として、「シグナル分子を活用した高機能化MSPC増殖培養法の確立」であるが、現在進めている細胞種の特定と、併せてCL/P発症に関与する因子の特定作業を進めている。先行研究で報告れたCL/Pのリスク因子、およびGWAS（genome wide associate study）研究による大規模スクリーニングにより特定された臍帯血SNPに含まれるCL/Pリスク因子を基に、本研究で検出するCL/P関連のGO termに含まれる因子から、機能的に確からしい因子の特定を行う。その結果として、妊娠期の末梢血での診断が可能かどうかを最終年度に立証する。また、健常由来解析データから骨分化に寄与する細胞集団を特定し、in vitroにて検証作業を進めていく。

次年度使用額が生じた理由

本年度、当初は健常臍帯組織由来細胞のみを用いて一細胞解析を実施する予定であったが、分担研究者の長村研究室よりCL/P由来臍帯細胞の供与があったため、CL/P発症原因メカニズム解析が群間比較により可能となった。したがって、一細胞解析を2検体分実施が可能となったが解析費用が当初予算より増加したことにより、当該年度余剰金を次年度に後ろ倒しにて使用することとなった。次年度に大規模解析を実施することから、資金負担は大幅に増加する見込みとなる。

研究成果

• [雑誌論文] Stem cell-based modeling and single-cell multiomics reveal gene-regulatory mechanisms underlying human skeletal development (2023)
  • 著者名/発表者名: Tani Shoichiro、Okada Hiroyuki、Onodera Shoko、Chijimatsu Ryota、Seki Masahide、Suzuki Yutaka、Xin Xiaonan、Rowe David W.、Saito Taku、Tanaka Sakae、Chung Ung-il、Ohba Shinsuke、Hojo Hironori
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 42 ページ: 112276～112276
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2023.112276
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Umbilical cord-derived mesenchymal stromal cell therapy to prevent the development of neurodevelopmental disorders related to low birth weight (2023)
  • 著者名/発表者名: Tsuji Masahiro、Mukai Takeo、Sato Yoshiaki、Azuma Yasue、Yamamoto Saki、Cayetanot Florence、Bodineau Laurence、Onoda Atsuto、Nagamura-Inoue Tokiko、Coq Jacques-Olivier
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 13 ページ: 3841~3857
  • DOI: 10.1038/s41598-023-30817-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-cell RNA sequencing unravels heterogeneity of skeletal progenitors and cell-cell interactions underlying the bone repair process (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakayama Mika、Okada Hiroyuki、Seki Masahide、Suzuki Yutaka、Chung Ung-il、Ohba Shinsuke、Hojo Hironori
  • 雑誌名: Regenerative Therapy 巻: 21 ページ: 9～18
  • DOI: 10.1016/j.reth.2022.05.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Runx2 regulates chromatin accessibility to direct the osteoblast program at neonatal stages (2022)
  • 著者名/発表者名: Hojo Hironori、Saito Taku、He Xinjun、Guo Qiuyu、Onodera Shoko、Azuma Toshifumi、Koebis Michinori、Nakao Kazuki、Aiba Atsu、Seki Masahide、Suzuki Yutaka、Okada Hiroyuki、Tanaka Sakae、Chung Ung-il、McMahon Andrew P.、Ohba Shinsuke
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 40 ページ: 111315～111315
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111315
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Runx2 and Runx3 differentially regulate articular chondrocytes during surgically induced osteoarthritis development (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagata Kosei、Hojo Hironori、Chang Song Ho、Okada Hiroyuki、Chijimatsu Ryota、Omata Yasunori、Makii Yuma、Kawata Manabu、Kaneko Taizo、Iwanaga Yasuhide、Nakamoto Hideki、Maenohara Yuji、Tachibana Naohiro、Ishikura Hisatoshi、Higuchi Junya、Taniguchi Yuki、Ohba Shinsuke、Chung Ung-il、Tanaka Sakae、Saito Taku
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 ページ: 6187~6204
  • DOI: 10.1038/s41467-022-33744-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Orally administrable peptides derived from egg yolk promote skeletal repair and ameliorate degenerative skeletal disorders in mouse models (2022)
  • 著者名/発表者名: Kitaura Yoshiaki、Nakamura Utano、Awada Chihiro、Yamaguchi Motonori、Kim Mujo、Ikeda Yuki、Matsuo Yuki、Moriishi Takeshi、Sawase Takashi、Chung Ung-il、Hojo Hironori、Ohba Shinsuke
  • 雑誌名: Regenerative Therapy 巻: 21 ページ: 584～595
  • DOI: 10.1016/j.reth.2022.11.002
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Clinical Study of Alveolar Bone Tissue Engineering Using Autologous Bone Marrow Stromal Cells: Effect of Optimized Cell-Processing Protocol on Efficacy (2022)
  • 著者名/発表者名: Kagami Hideaki、Inoue Minoru、Agata Hideki、Asahina Izumi、Nagamura-Inoue Tokiko、Taguri Masataka、Tojo Arinobu
  • 雑誌名: Journal of Clinical Medicine 巻: 11 ページ: 7328～7328
  • DOI: 10.3390/jcm11247328
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9 and AAV mediated insertion of β2 microglobulin-HLA-G fusion gene protects mesenchymal stromal cells from allogeneic rejection and potentiates the use for off-the-shelf cell therapy (2022)
  • 著者名/発表者名: Meshitsuka Sohsuke、Ninomiya Ryo、Nagamura-Inoue Tokiko、Okada Takashi、Futami Muneyoshi、Tojo Arinobu
  • 雑誌名: Regenerative Therapy 巻: 21 ページ: 442～452
  • DOI: 10.1016/j.reth.2022.09.009
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Immunological influence of serum-free manufactured umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for steroid-resistant acute graft-versus-host disease (2022)
  • 著者名/発表者名: Nagamura-Inoue Tokiko、Kato Seiko、Najima Yuho、Isobe Masamichi、Doki Noriko、Yamamoto Hisashi、Uchida Naoyuki、Takahashi Atsuko、Hori Akiko、Nojima Masanori、Ohashi Kazuteru、Nagamura Fumitaka、Tojo Arinobu
  • 雑誌名: International Journal of Hematology 巻: 116 ページ: 754～769
  • DOI: 10.1007/s12185-022-03408-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] intra-single cell sequencing (iSCseq) spotlights transcriptomic and epigenetic heterogeneity inside multinucleated osteoclast (2022)
  • 著者名/発表者名: Okada Hiroyuki、Terui Yuta、Omata Yasunori、Seki Masahide、Tani Shoichiro、Miyahara Junya、Makabe Kenta、Terashima Asuka、Kanazawa Sanshiro、Hosonuma Masahiro、Yano Fumiko、Kajiya Hiroshi、Saito Taku、Suzuki Yutaka、Okabe Koji、Baron Roland、Tanaka Sakae、Chung Ung-il、Hojo Hironori
  • 雑誌名: bioRxiv 巻: 0 ページ: 0~0
  • DOI: 10.1101/2022.09.05.506360
• [雑誌論文] Offset nail fixation for intertrochanteric fractures improves reduction and lag screw position (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsubara Takehiro、Soma Kazuhito、Yamada Ikufumi、Fujita Hiroshi、Yoshitani Junya、Oka Hiroyuki、Okada Hiroyuki、Tanaka Sakae
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 17 ページ: 0276903～0276903
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0276903
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RSPO2 defines a distinct undifferentiated progenitor in the tendon/ligament and suppresses ectopic ossification (2022)
  • 著者名/発表者名: Tachibana Naohiro、Chijimatsu Ryota、Okada Hiroyuki、Miyahara Junya、Ishikura Hisatoshi、Arino Yusuke、Nagata Kosei、Nakamoto Hideki、Kato So、Doi Toru、Matsubayashi Yoshitaka、Oshima Yasushi、Terashima Asuka、Omata Yasunori、Yano Fumiko、Maeda Shingo、Suzuki Yutaka、Tanaka Sakae、Saito Taku
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 8 ページ: 2138~2154
  • DOI: 10.1126/sciadv.abn2138
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa Sanshiro、Okada Hiroyuki、Riu Dan、Mabuchi Yo、Akazawa Chihiro、Iwata Junichi、Hoshi Kazuto、Hikita Atsuhiko
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 23 ページ: 8238～8238
  • DOI: 10.3390/ijms23158238
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Interspecies Single‐Cell RNA‐Seq Analysis Reveals the Novel Trajectory of Osteoclast Differentiation and Therapeutic Targets (2022)
  • 著者名/発表者名: Omata Yasunori、Okada Hiroyuki、Uebe Steffen、Izawa Naohiro、Ekici Arif B.、Sarter Kerstin、Saito Taku、Schett Georg、Tanaka Sakae、Zaiss Mario M.
  • 雑誌名: JBMR Plus 巻: 6 ページ: 10631~10645
  • DOI: 10.1002/jbm4.10631
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Plasmalemmal interface for calcium signaling in osteoclast differentiation (2022)
  • 著者名/発表者名: Okada Hiroyuki、Tanaka Sakae
  • 雑誌名: Current Opinion in Cell Biology 巻: 74 ページ: 55～61
  • DOI: 10.1016/j.ceb.2022.01.001
  • 査読あり
• [学会発表] ELUCIDATING GENE REGULATORY NETWORKS UNDERLYING HUMAN SKELETAL DEVELOPMENT BY INTEGRATING SINGLE-CELL DYNAMICS OF CHROMATIN ACCESSIBILITY AND GENE EXPRESSION (2022)
  • 著者名/発表者名: Shoichiro Tani, Hiroyuki Okada, Masahide Seki, Yutaka Suzuki, Ung-il Chung, Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
  • 学会等名: ISSCR 2022
  • 国際学会
• [学会発表] １細胞多層解析を用いたヒト骨発生における遺伝子制御ネットワークの解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 谷 彰一郎, 岡田 寛之, 齊藤 琢, 田中 栄, 鄭 雄一, 北條 宏徳, 大庭 伸介
  • 学会等名: 第40回日本骨代謝学会
• [学会発表] Elucidating Gene Regulatory Networks Underlying Human Skeletal Development by Integrating a Model of Human Endochondral Bones and Single-cell Multiomics (2022)
  • 著者名/発表者名: Shoichiro Tani, Hiroyuki Okada, Masahide Seki, Yutaka Suzuki, Taku Saito, Sakae Tanaka, Ung-il Chung, Hironori Hojo and Shinsuke Ohba
  • 学会等名: ASBMR 2022
  • 国際学会
• [学会発表] Understanding mechanisms underlying cell fate specification of dental mesenchymal cells in the developing tooth germ through single-cell transcriptome (2022)
  • 著者名/発表者名: Dahlia Eldeeb, Hironori Hojo, Hiroyuki Okada, Yutaka Suzuki, Masahide Seki, Junichi Tanaka, Shinsuke Ohba, Ung-il Chung
  • 学会等名: MBSJ 2022
• [学会発表] intra-single cell sequencing（iSC-seq）による破骨細胞の多核間制御メカニズム解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 岡田寛之, 照井悠太, 小俣康徳, 関真秀, 谷彰一郎, 宮原潤也, 真壁健太, 寺島明日香, 金澤三四朗, 細沼雅弘, 矢野文子, 鍛治屋浩, 斎藤琢, 鈴木 穣, 岡部幸司, Roland Baron, 田中栄, 鄭雄一, 北條宏徳
  • 学会等名: NGS expo 2022
• [学会発表] The gene expression and epigenetic regulation of individual nuclei within the same osteoclast is heterogeneous: Evidence from Intra-single cell sequencing (iscSeq) (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Okada, Shoichiro Tani, Yasunori Omata, Asuka Terashima, Taku Saito, Roland Roland, Sakae Tanaka, Ung-il Chung, Hironori Hojo
  • 学会等名: 第95回日本生化学大会
• [学会発表] intra-single cell sequencing( iSC-seq )による破骨細胞の多核間制御メカニズム解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 岡田寛之、照井悠太、小俣康徳、関真秀、谷彰一郎、宮原潤也、真壁健太、寺島 明日香、細沼 雅弘、矢野 文子、斎藤 琢、鈴木 穣、Roland Baron、田中栄、 鄭 雄一、 北條 宏徳
  • 学会等名: 第9回日本リウマチ学会ベーシックリサーチカンファ
• [学会発表] The gene expression and epigenetic regulation of individual nuclei within the same multinucleated osteoclast is heterogeneous: Evidence from Intra-single cell sequencing (iscSeq) (2022)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Okada, Yuta Terui, Yasunori Omata, Shoichiro Tani, Asuka Terashima, Taku Saito, Roland Baron, Sakae Tanaka, Ung-il Chung, Hironori Hojo
  • 学会等名: 第45回日本分子生物学会年会