| 研究課題/領域番号 |
22K10221
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
緒方 謙一 九州大学, 大学病院, 助教 (30778858)
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| 研究分担者 |
森山 雅文 九州大学, 大学病院, 助教 (20452774)
吉岡 弘毅 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 研究員 (30756606)
中村 誠司 九州大学, 歯学研究院, 教授 (60189040)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / エクソソーム |
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| 研究実績の概要 |
1. iPS細胞作製について
ロンザ社より購入したヒト歯髄幹細胞をメーカー指定の専用培地で80%コンフルエントになるまで培養した。細胞を回収した後、プラスミドDNA （Oct3/4、Sox2、Klf4、c-MycおよびDsRed）（OPTI-MEMTMI : Invitrogen社）を作用させたのち、PLAT-E 細胞に滴下し培養した。培養11目からpuromycin 選択を開始し、歯髄幹細胞由来のiPS細胞を3種類樹立した（iPS 1, iPS 2, iPS 3と定義）。また、未分化性の確認については、Oct3/4およびSSEA-4による蛍光免疫染色を施行した。
2.iPS細胞からエクソソーム（EVs）回収について
樹立した3種類のiPS細胞からEVs回収にあたっては、Cellartis; DEF-CS8482; 500 Culture System（タカラバイオ株式会社）を使用した。培養方法については、過去の報告に準じて行った。80%コンフルエント時にCellartis; MSC Xeno-Free Culture Medium（タカラバイオ株式会社）に培地交換し、48時間後にCMを回収した。回収したCMを超遠心機（himac CP80NX：日立工機）を用いて4℃、100000 × gで70分間超遠心した。これを4回繰り返したのち、PBSに再懸濁し、実験使用まで－80℃で保存した。れらのEVsの形態と表面マーカーを調べたところ、EVsの大きさはともに200 nm前後であり、表面マーカーはCD9, CD81をともに認めた（図1b）。よって、樹立したiPS細胞は未分化性を有し、かつ細胞能力に差があることが示された。また、それらからのEVsは大きさや表面マーカーに違いは認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在までにiPS細胞の樹立とそれから回収したエクソソームの表面抗原の精査は終わっている。今後は、in vivoの実験に移って、その効果および作用機序を解明する。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は動物実験を使った実験を主に予定している。具体的には以下を予定している。
・シェーグレン症候群モデルマウスを使用したiPS細胞由来エクソソームの治療効果の検討。検討内容としては、唾液量の検査、抗SS-A抗体・抗SS-B抗体の検査、唾液腺組織のHE染色、qPCRを行う。もし今後iPS細胞由来のエクソソームに治療効果が認められなくても、そのマイクロRNAを検索することで、今後の研究材料になると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
参加予定であった学会に参加できなかったことと細胞培養に関する物品費の購入、特に新規細胞購入の必要性がなくなったため。
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