| 研究課題/領域番号 |
22K10245
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
早野 暁 岡山大学, 大学病院, 講師 (20633712)
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| 研究分担者 |
宝田 剛志 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (30377428)
井澤 俊 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (30380017)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | Fillamin A / 口蓋発生 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的である、口蓋突起癒合部におけるFillamin A (Flna)の発現が口蓋の発生に与える影響を調べるため、本年度は主に以下の３項目の研究を実施した。
①器官培養実験：我々がこれまでに確立してきた、マウス胎児口蓋の器官培養法を用いて、口蓋突起部上皮消失の重要な因子であるTGF-βとFlnaとの関係を検討した。具体的にはTGF-β阻害薬およびTGF-βの下流で活性化するRhoA阻害薬、さらに、siRNAを用いたFlnaのノックダウンを行い、器官培養中の口蓋でどのような反応が生じるかを観察した。この結果、TGF-β阻害薬およびRhoA阻害薬を添加した培養液を用いたマウス胎児口蓋では、Flnaタンパクの産生が著しく低下していた。これらのことからFlnaは既報のTGF-βやRhoAシグナルの下流で働いていることが示唆された。
②In vitro実験：器官培養法で得られた上記の結果をより詳細に調べるため、ヒト表皮角化細胞であるHaCat細胞を用いてTGF-β経路下流で発現するFlnaと上皮間葉転換について検討した。この結果の解釈に関しては追加で実験を行う必要があると考えられる。
③遺伝子改変マウスの作成：上皮細胞特異的にFlnaをノックダウンさせるため、KRT14-CreマウスとFlna floxマウスをどちらもJackson Laboratoryから購入した。凍結胚からそれぞれの遺伝子改変マウスを作出し、現在交配を続けている。現段階で交配に問題は認められず、約3か月程度で目的のマウスが得られる予定である。
また、上記項目以外に、Nanostring社のGeoMXを用いた空間的トランスクリプトーム解析を行うための準備実験を行なった。具体的には、胎生14日マウス胎児口蓋のパラフィン切片を作成し、パラフィン切片でも検出できるFlna抗体の選定を行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初はマウス胎児口蓋の器官培養法を用いたFLNAタンパクの機能解析と遺伝子改変マウスの作成を初年度に行う予定であったが、In vitro実験を行うことによりさらなる情報を得ることができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は以下の3項目の研究を進めていく。
①遺伝子改変マウスの解析：口蓋の癒合は胎生14日前後に生じる。このためタイムドメイティングを行いKRT14-Cre; Flna flox/floxマウス胎児を解析する。具体的には、口蓋突起癒合部の免疫染色や同部から抽出したタンパクをウエスタンブロット法にて解析する。
②HaCat細胞を用いたIn vitro実験：上記のIn vitro実験で得られた情報を展開・発展させるため、Wnt/β-Catenin経路に関わる抗体などを用いて実験を繰り返す必要がある。
③空間的トランスクリプトーム解析：我々は予備実験として10x社のVisiumを用いた時空間的トランスクリプトーム解析を行なったが、今後はより解像度が高く、Flnaを産生している細胞特異的にトランスクリプトーム解析を行うため、Nanostring社のGeoMXを用いた解析を行う。これにより、Flnaを産生している口蓋突起先端被覆上皮特異的な発現遺伝子解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に高額試薬購入予定であったが、予算が足りなかった。そのため次年度予算として繰越し、試薬を購入することとした。
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