| 研究課題/領域番号 |
22K10352
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| 研究機関 | 鶴見大学 |
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研究代表者 |
村田 貴俊 鶴見大学, 歯学部, 講師 (10313529)
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| 研究分担者 |
宮之原 真由 鶴見大学, 歯学部, 学部助手 (70460186)
山下 万美子 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (20909676)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | Streptococcus mutans / 脳卒中 / コラーゲン結合タンパク |
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| 研究実績の概要 |
コラーゲン結合タンパクを発現するStreptococcus mutans（ミュータンス菌）感染と脳卒中発症との関連が報告されている。このコラーゲン結合タンパクは、細胞壁を構成するペプチドグリカンと共有結合し、ミュータンス菌最外層に存在している。一方、脳卒中罹患部からのミュータンス菌体単離の報告はないことから、菌体そのものではなく、菌体外に分泌、または剥離するコラーゲン結合タンパクが病原因子である可能性がある。これまでの研究成果として、ミュータンス菌培養上清中にコラーゲン結合タンパクを含む複合体をウェスタンブロッティング法で確認している。
研究当該年度には、ミュータンス菌培養上清からコラーゲン結合タンパク複合体の単離・同定を試みた。その方策として、抗コラーゲン結合タンパクポリクローナル抗体を作製し免疫沈降法を行い単離を試みた。しかしながら、使用した抗体とミュータンス菌が分泌するグルコシルトランスフェラーゼが交差反応を示し、質量分析法によるコラーゲン結合タンパク複合体の同定を阻害することが判明した。この問題を解決するため、ミュータンス菌が有する3種類全てのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊したミュータンス菌株を作製した。この株の培養上清には抗体と交差反応を示すグルコシルトランスフェラーゼを全く含まないため免疫沈降法によるコラーゲン結合タンパク複合体単離を容易にする。その後の質量分析法による同定に資するサンプルが得られるはずである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究過程で免疫沈降法に使用する抗コラーゲン結合タンパク抗体が、S. mutansが分泌するグルコシルトランスフェラーゼと交差反応を示し、質量分析法に資するコラーゲン結合タンパク複合体の単離が難しくなった。その解決方策として3種類全てのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊したS. mutans株を作製することにした。破壊株作成に若干の時間を要し、研究課題の進捗に影響を与えたため、やや遅れているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
３種類全てのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊したS. mutans株の作製に若干の時間を要しているが、この遺伝子破壊株を使用してコラーゲン結合タンパク複合体の単離・同定を目指す。
複合体の同定後に、研究計画に従い、大腸菌の異種発現系で発現させたリコンビナントコラーゲン結合タンパクのコラーゲン結合能、血管内皮細胞への侵入能、脳出血の誘発能を評価する。
研究の過程で、コラーゲン結合タンパクの病原性がそれ自体ではなく、複合体を構成する結合分子に依存すると想定される場合、その結合する分子がタンパク質であれば新たな異種発現系構築の対応を取らなければならない。タンパク質以外であれば、複合体を得るためのS. mutans大量培養システム構築の対応を取らなければならない。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
参加予定の国際学会（IADR）、国内学会（日本口腔衛生学会）が、新型コロナウイルス感染症流行の影響によりバーチャル開催となり計上していた旅費が未使用となった。
免疫沈降法に使用した抗体の目的外分子との想定外の交差反応により若干の研究停滞が生じた。そのため、使用期限のある微生物用培地や試薬類購入を次年度に回した。
次年度には想定の研究計画に追いつく予定であり、そのために必要な物品費として使用する予定である。
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