| 研究課題/領域番号 |
22K11850
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
小林 翔 山形大学, 農学部, 准教授 (10779490)
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| 研究分担者 |
佐藤 英世 新潟大学, 医歯学系, 教授 (60235380)
塩野 義人 山形大学, 農学部, 教授 (80361278)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | グルタチオン代謝 / システイン供給 / 脂溶性抗酸化能 / フェロトーシス |
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| 研究実績の概要 |
細胞内の主要な抗酸化物質であるグルタチオンの枯渇が引き金になり、鉄イオン依存性細胞死（フェロトーシス）が誘導される。本研究では、申請者らがフェロトーシス抑制遺伝子として同定したCNDP2の生体内での生理機能の解明を目指した研究を行っている。
CNDP2はグルタチオン分解により細胞内のシステイン再利用系として機能することが予想されるため、本機能の解析のためにゲノム編集によりCNDP2を欠損するマウス肝臓がん細胞由来細胞株Hepa1-6の作成に取り組んだ。Cas9を安定的に発現するHepa1-6細胞に対して、CNDP2のエキソン1部位を認識するガイドRNAと共にブラストサイジン耐性遺伝子を導入し、ブラストサイジン耐性細胞を選抜した。ウエスタンブロット解析の結果、CNDP2の完全な欠損を認めた。さらに、非特異的な配列を導入したコントロール細胞(Scr cells）はシスチン欠乏によるフェロトーシスがGSH添加により救済されるのに対して、樹立したCNDP2欠損細胞（CNDP2 KO cells）はシスチン欠乏下でのGSH添加に対しては救済されないことがわかり、予想通り、CNDP2はグルタチオン分解によるシステイン再利用系として機能することが示唆された。現在、作成した細胞の表現型を詳細に検討中である。
食品由来のフェロトーシスを抑制する化合物の探索のため、シスチン輸送体xCTを欠損する細胞を用いて、昨年度に加えてさらに10種類上の食品抽出物を加え、計30種類以上の食品抽出物のスクリーニングを実施した。その結果、ネギ属の野菜やパプリカ、カリフラワーなどにフェロトーシス抑制効果が見出された。今後、これらの食品抽出物とCNDP2や細胞内レドックス関連遺伝子との関連について解析し、フェロトーシス抑制メカニズムの解明を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ゲノム編集でのCNDP2欠損培養細胞株の作製と個体での病態モデルの検討に時間を要しているため、やや遅れていると判断した。
令和5年度は、国際共同研究の実施により、Cas9を安定的に発現するマウス肝臓がん細胞株Hepa1-6を用いて、CNDP2のガイドRNAを導入することで、CNDP2欠損細胞を作出することに成功したが、その作成に時間を要してしまい、その表現型の詳細な解析までは至らなかったが、今年度で詳細な解析を進める予定である。
令和5年度に山形大学医学部メディカルサイエンス推進研究所動物実験センターに助力を仰ぎ、腎臓摘出の手法を習得しているため、令和6年度に腎臓摘出による腎障害モデルでの検討を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請者は研究代表者として研究全般を実施し、研究分担者の佐藤（新潟大学）はアミノ酸代謝に関わる細胞解析と研究計画等への助言を行い、同じく塩野（山形大学）は微生物抽出物からの化合物の単離、精製ならびに化学構造の解析を実施する。
(1)CNDP2遺伝子欠損マウス由来細胞やゲノム編集によりCNDP2を欠損させた細胞を用いて、生化学的解析により、フェロトーシスへの感受性やフェロトーシス関連遺伝子との関係を解析する。
(2)山形大学創薬研究拠点が所有する化合物ライブラリーと研究分担者の塩野の所有する微生物抽出物または様々な食品抽出物を用いて、CNDP2を特異的に阻害する化合物の探索を行う。また、これまでの検討によって、いくつかの食品抽出物がフェロトーシスを抑制する効果が見いだされたため、上記(1)で作製したCNDP2欠損細胞などを用いて、フェロトーシス抑制効果とCNDP2との関係を明らかにする。
(3)腎臓摘出により腎障害が重度になると予想されるCNDP2欠損マウスにおいて、腎機能マーカーの血中尿素窒素（BUN）やクレアチニンの測定と組織学的解析を行う。
(4)脳におけるCNDP2の機能解析のため、ステップスルー法による学習習得・記憶保持機能の検討と共に脳の組織学・生化学解析と遺伝子発現解析を行い、CNDP2と脳機能との関係を明らかにする。
研究成果を発表し、最先端の情報を収集するために、日本生化学会大会（2024年11月6日-8日、横浜）に参加を予定している。また、3年間の研究成果を論文として発表する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ計画通りに予算を執行したが、若干の次年度使用額が生じた。
次年度では物品費の一部として利用する予定である。
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