| 研究課題/領域番号 |
22K12435
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| 研究機関 | 別府大学 |
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研究代表者 |
藤原 秀彦 別府大学, 食物栄養科学部, 教授 (10435167)
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| 研究分担者 |
末永 光 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (90357252)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | 水平伝播 / ICE / ビフェニル |
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| 研究実績の概要 |
本研究はビフェニル/PCB 分解菌 Pseudomonas putida KF715 株の有する可動性遺伝因子 ICEbph-sal の不安定さをもたらす鍵遺伝子や環境因子等を網羅的に解析することを目的としている。
2022年度は KF715 株のビフェニル分解 (bph) 遺伝子群とサリチル酸分解 (sal) 遺伝子群の周辺に存在する、水平伝播に関わるインテグラーゼやレトロエレメント、トランスポザーゼ等の10の可動性遺伝因子の破壊を試みた。破壊は同じ Pseudomonas 属細菌である P. aeruginosa の遺伝子破壊用に開発された pnCasPA-BEC システムを用いた。本システムは CRISPR-Cas9 を利用し、塩基編集によるナンセンス変異を導入により遺伝子破壊を行うものであり、従来の相同組換えによる遺伝子破壊と比較すると容易に塩基置換が起こり、かつ、多重変異株の取得も容易であるというのが特徴である。
その結果、10遺伝子全てにおいて破壊用ベクターの構築に成功した。野生株への導入の結果、インテグラーゼと、トランスポザーゼの2遺伝子の破壊に成功した。相同組換えを行った際にはインテグラーゼ破壊株の構築には多くの時間を費やしたため、pnCasPA-BEC を用いた塩基編集を行うことの有用性が示された。他の8遺伝子に関しても今後速やかに破壊予定であり、現在取得済みの破壊株に関しても多重破壊株の取得を試みる。すべての遺伝子破壊が終了した後に野生株との表現型の比較を行う予定である。一方で、bph 遺伝子と sal 遺伝子の中間領域 (上記 10 遺伝子のうち 9 遺伝子が存在) を削った株も構築予定である。
また、当該年度では分解遺伝子群の遺伝子進化に関する論文執筆を行い、現在投稿中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2022年度では10 遺伝子すべての破壊株の構築と多重破壊株の構築を予定していたが、現在2遺伝子の破壊株の構築にとどまっている。しかしながら、すでに破壊用ベクターは完成しているため、破壊株の取得は早期に可能である。その後に野生株と形質の比較をおこない2023年度にはトランスクリプトーム解析を開始することが十分に可能であると判断できるため、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画に従い、着実に研究を遂行する。現在構築している一遺伝子破壊株だけでなく、多重破壊株も同時進行的に構築し、野生株との比較を行い水平伝播の生起予測システムの構築を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において、破壊株を10株作成予定だったものが2株のみであった。その結果、シーケンス解析に関する予算に余剰が生じ、次年度使用額が生じた。
次年度は、当該年度にできなかった破壊株の作成を試み、かつシーケンス解析を行うため、次年度使用額を適切に消化する計画である。
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