高感度発光プローブを用いたAktシグナル伝達の一細胞解析法の開発

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K14779
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 河村 玄気 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任研究員 (10852791)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 発光プローブ / Akt / 解糖系 / ルシフェラーゼ / イメージング

研究実績の概要

本研究ではAkt活性動態を測定する高感度な発光プローブを開発することで時空間的なAkt活性動態の意義に迫ることを目標としている。本年度においてはAkt発光プローブの改良を進め、Akt活性化刺激、および活性阻害刺激によりプローブの発光量が変化することを確認した。また、本研究で開発するプローブの原理がAkt以外のキナーゼ活性の測定にも応用が可能であることを示すため、細胞周期関連キナーゼCDK2の活性測定系の構築し、発光量が細胞増殖阻害刺激に応答して変化することを確認した。開発した発光プローブが一細胞レベルでの測定に資することを確認するため発光顕微鏡にて観察を行ったところ、プローブ由来の発光はルシフェラーゼが再構成する核で生じていることを確認できた。この結果はプローブが想定通りの機構により再構成し、それに伴う発光が測定されていることを示唆している。また、発光プローブに蛍光タンパク質を融合することで発光波長の長波長化に成功した。今後は、Aktのみならず様々なキナーゼ活性を高感度、かつマルチプレックスな測定が可能な測定原理として確立することを目指す。
また、昨年度までに光活性化型Aktを用いた統合オミクス解析によりAkt単体の活性化により制御される代謝経路として解糖系の下流を特定した。そこで、本年度は解糖系下流代謝物である乳酸の蛍光バイオセンサーを用い、Akt活性化と乳酸量変化の一細胞測定を行った。結果、Aktを光により活性化した際の細胞内乳酸濃度の変化、また、グルコース存在下でのAkt活性と細胞内乳酸量変化を一細胞レベルで測定することができた。そこで、この測定データを用い、最終的に乳酸産生へとつながる解糖系下流とAktの活性動態との関連を模式化した数理モデルを構築することで解糖系下流を対象としたAkt活性動態が与える代謝応答の解析を行う。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Akt発光プローブに関しては未刺激時の発光量を抑えることで性能の改良を図った。具体的には、未刺激時に既に再構成して発光するルシフェラーゼ量を減らすため、分解配列を導入することで非特異的に再構成しているルシフェラーゼが減少するような設計を施した。結果、Akt活性プローブについては、通常培養時からAkt阻害時には最大で20倍程度の変化率が観測され、またAkt活性化刺激に対しては最大で1.5倍程度の発光量変化が観測されたため、分解配列の導入により性能が向上したことを確認できた。また、プローブの発光とプローブの細胞内局在とを顕微鏡を用いて同時に測定したところ、約7割の細胞では発光と蛍光観察されたプローブの局在とが相関していたのに対し、一部の細胞では相関していなかった。そのため、細胞に導入するプローブの量比を最適化する必要があることが分かった。また、発光プローブの測定原理の汎用性を確認するため、同原理を適用した細胞周期関連キナーゼCDK2の活性を測定する発光プローブを開発した。開発したプローブでは細胞周期阻害により約3倍の発光量変化が測定されたため、本研究で考案した発光プローブの測定原理が様々なキナーゼ活性の測定に応用できることが分かった。
数理モデル解析においては、解糖系下流代謝物である乳酸の細胞内における存在量変化とAkt活性動態との関連を数理モデルで解析するための準備を進めた。一細胞測定の結果、Akt活性化により細胞内乳酸量が増加する結果が得られた一方で、グルコース刺激に対する乳酸量変化と比較するとAkt単体の活性化による乳酸量変化は小さく、定量的な測定が困難であった。そこで、グルコース存在下でのAkt活性化による解糖系への影響を乳酸量変化から解析するモデルを構築することにし、モデル構築に必要な測定の検討を行った。

今後の研究の推進方策

Akt発光プローブに関しては、測定原理であるルシフェラーゼ再構成に関する改良を行う。具体的には、ルシフェラーゼ分割断片の細胞内存在量比の偏りによる非特異的な発光を抑えるため、細胞へのプローブの導入方法を検討することで最適な分割断片の存在量比を実現する。現在までにAkt活性の阻害に対しては20倍程度の変化率が得られているため、活性化に対しても同程度の変化率を達成することで高感度なAkt活性の検出系としての確立できることが期待される。また、本発光プローブの測定原理はAktのみならずCDK2の活性測定にも応用可能であることが分かった。本研究で提案する測定原理は汎用的であるため、同様に測定原理をその他のキナーゼにも適用することでより広範な対象を測定できることを示す。また、プローブの発光を発光エネルギー遷移により発光波長を長波長シフトさせることにより、スペクトル分解により複数種類の測定プローブと同時に観測可能とすることで複数キナーゼの活性をマルチプレックスに観測できる系として確立する。以上により構築される発光測定系は本研究で応用として想定している一細胞解析のみならず、キナーゼ活性を指標としたスクリーニングアッセイなど幅広い対象に応用できることが期待される。
数理モデルに関しては、グルコース刺激条件下でのAkt活性と細胞内乳酸量を一細胞レベルで測定する系を確立した。今後はグルコース存在下でのAkt活性が解糖系に与える影響を模式化し、Akt活性と解糖系とを関連付けるモデルの確立を目指す。具体的には、Aktの活性化が細胞内乳酸量を増加したことから、まずAkt活性と細胞内乳酸量との関連を模式化し、さらに測定可能な変数である細胞内乳酸の測定値を基にパラメータ推定を行うことで数理モデルを構築する。

次年度使用額が生じた理由

研究計画においては細胞実験や発光アッセイにおける基質など、細胞を用いた実験系のために予算を多く計上したが、本年度はプローブの構築や計算機解析を中心に行ったため、実際に細胞実験を中心に行う次年度のための使用額が生じた。これら次年度使用額に関しては、当初の予定通り細胞実験に関連した消耗品などに費やす予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Lactate biosensors for spectrally and spatially multiplexed fluorescence imaging (2023)
  • 著者名/発表者名: Nasu Y., Aggarwal A., Le Giang N. T., Vo Camilla T., Kambe Y., Wang X., Beinlich F. R. M., Lee A. B., Ram T. R., Wang F., Gorzo K. A., Kamijo Y., Boisvert M., Nishinami S., Kawamura G., Ozawa T., Toda H., Gordon G. R., Ge S., Hirase H., Nedergaard M., Paquet M. E., Drobizhev M., Podgorski K., Campbell R. E.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 14 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41467-023-42230-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Development of bioluminescent probes to analyze the role of NADPH oxidase 1 function in circadian clock synchronization (2024)
  • 著者名/発表者名: Genki Kawamura
  • 学会等名: 日本化学会第104春季年会
• [学会発表] Analysis of cellular BMAL1 localization during the early stage of circadian clock synchronization in fibroblast (2023)
  • 著者名/発表者名: Genki Kawamura
  • 学会等名: 第30回日本時間生物学会学術大会
• [学会発表] ROS generation by NADPH oxidase 1(NOX1) mediates clock synchronization in mouse fibroblasts (2023)
  • 著者名/発表者名: Genki Kawamura
  • 学会等名: 第46回日本分子生物学会年会