| 研究課題/領域番号 |
22K14809
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
神田 健 筑波大学, 医学医療系, 特別研究員(PD) (20932586)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | 大腸菌 / sRNA / GcvB / 転写後調節 / 芳香族アミノ酸 / トランスポーター |
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| 研究実績の概要 |
2022年度の研究成果は、主に以下の2点である。
①GcvB sRNAが大腸菌の芳香族アミノ酸代謝を制御する分子メカニズムの解明
まず、芳香族アミノ酸（Phe、Tyr、Trp）の生合成酵素およびトランスポーターをコードする全ての遺伝子（制御が既知のものを除いて20遺伝子）に対してin silico解析を実施し、GcvBとの塩基対形成領域を予想した。次に、この予想領域周辺をgfp遺伝子に融合しレポーターアッセイを行ったところ、GcvBの高発現により14遺伝子の翻訳レベルが変化した。さらにこれらから生理的なターゲットを絞り込むため、GcvBをアラビノース誘導性プロモーターから短時間（10分間）発現させ、各遺伝子のRNAレベルの変化をRT-qPCRにより定量した。その結果、生合成酵素であるAroG、PheA、TrpC、さらにトランスポーターであるPhePをコードするmRNAは、GcvB発現により有意に減少した。以上の結果より、これら4遺伝子はGcvBが塩基対形成することで翻訳が抑制され、かつRNAが不安定化される新規ターゲットであると考えられる。
②GcvB sRNAによる芳香族アミノ酸代謝の制御がもたらす増殖への影響の解析
最小培地を用いて培養実験を行ったところ、ベクターコントロールでは芳香族アミノ酸添加に伴い増殖が増大したが、GcvB高発現株ではそのような増大は見られなかった。また、タンパク質構成アミノ酸20種から芳香族アミノ酸を除いた17種のみを添加した最小培地では、ベクターコントロールと比較して、GcvB高発現株の増殖に遅延が見られた。これらの現象は、GcvBが芳香族アミノ酸のトランスポーターおよび生合成酵素の翻訳を抑制することで生じたと考えることができ、①で解明した分子生物学的知見に一致した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2022年度は、GcvBが塩基対形成するターゲットRNAを特定し、さらにin silico解析および変異実験によりその結合領域の解明にも成功した。これらの成果は、GcvBによる芳香族アミノ酸代謝の制御の全体像を解明できたものと考えている。次年度は、これらの知見を活用することで、大腸菌酸耐性の制御との関連を効果的に解析することができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究は、主に以下の3項目に従い実施する。
【①インドール生産レベルの定量】GcvBによる芳香族アミノ酸代謝の制御が、酸耐性機構（GADシステム）の抑制シグナルであるインドールの生産に影響しているか、培養上清中のインドールレベルを定量することで評価する。
【②GcvBによる酸耐性制御の解析】GcvBの高発現株および破壊株において、GADシステム発現レベルや強酸環境中での生残率等を評価する。
【③GcvBによる酸耐性制御の阻害法の確立】GcvBと特異的に塩基対形成することで制御能を失わせるアンチセンスsRNAを開発し、酸耐性に対する阻害活性を評価する。
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