| 研究課題/領域番号 |
22K14821
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| 研究機関 | 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構 |
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研究代表者 |
藤田 雅也 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 学振特別研究員 (50923471)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | リグニン / 細菌内膜 / MFSトランスポーター |
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| 研究実績の概要 |
初年度は、2種類のMFS輸送体の精製タンパク質取得方法を確立し、クライオ電顕を用いた単粒子解析、等温滴定型熱量測定(ITC)による基質との結合解析を行った。精製タンパク質の取得にはすでに成功していたが、培養時間やbuffer条件などを最適化することにより、これまでの2倍以上の収量で精製タンパク質を得ることに成功した。また、ナノディスクへの再構成法も確立した。界面活性剤に可溶化した目的タンパク質、およびナノディスクい再構成した同タンパク質を用いて、クライオ電顕を用いた単粒子解析を行なった結果、それぞれ4オングストローム、6オングストロームの構造を得ることに成功した。界面活性剤に可溶化した目的タンパク質のデータセットについては現在解析途中であり、今年度中の構造決定が可能であると考えている。また、ナノディスクに再構成した目的タンパク質と、基質との相互作用をITCにより検出することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度に予定していた構造解析が順調なため。また、ナノディスクへの再構成法を確立し、ITCによる相互作用解析の手法も確立できたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、目的タンパク質を人工膜に再構成し、基質の取り込みアッセイ方法を確立する。取り込み能は、蛍光分光光度計、または電気化学的な手法により評価する予定である。加えて、クライオ電顕により、2種類のMFS輸送体の構造を決定する。取り込み機序の理解に十分な分解能で構造が得られたら、変異体の解析により、取り込みに重要な残基を決定する。また、特定の残機に変異を導入することにより、異なる基質の取り込み能を付与できないかを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
精製タンパク質を効率的に取得する方法を確立できたため、想像よりも界面活性剤の使用を抑えられた。そのため、次年度使用額が生じた。今年度の解析には大量の精製タンパク質が必要なため、界面活性剤の購入に当てる予定である。
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