| 研究課題/領域番号 |
22K15011
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
南 昌平 大阪大学, 微生物病研究所, 特任研究員(常勤) (80889460)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | コロラドダニ熱ウイルス / マダニ媒介性感染症 / リバースジェネティクス |
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| 研究実績の概要 |
昨年度、確立したリバースジェネティクス法を用いた組換えコロラドダニ熱ウイルス(CTFV)の回収効率を上げるためにCTFVを様々な培養細胞へと感染させ、その増殖性を検討した。その結果、検討したすべての細胞株でCTFVは増殖することがわかり、いくつかの細胞株はリバースジェネティクス法に用いているBHK-T7/9細胞やVero細胞よりも高い増殖性を示した。
そこで、トランスフェクションしたBHK-T7/9細胞と共培養する細胞をVero細胞からCTFV高増殖性細胞へと変更することで回収効率と培養期間を短縮することに成功した。
また、この改善されたシステムを用いることで、VP12のC末端側にペプチドタグや350bpの大きさの外来遺伝子であるminiGFPが挿入された組換えCTFVを回収することができた。しかし、感染細胞ではminiGFPによる蛍光が確認できなかった。VP12の発現量が低いあるいはminiGFPが融合タンパク質として機能しにくい性質を持つことが考えられた。
また、抗原性の高いタンパク質としてVP5,VP7が候補として挙げられ、これらに対する抗血清の回収に成功した。今後は抗体を用いた解析も可能となった。
野生型CTFVをマウスやハムスターへ腹腔内、筋肉内、皮内接種によって感染させたが、ウイルスは殆ど増殖せず、動物モデルとしては不充分な病態であることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
リバースジェネティクス法は回収効率の改善ができ、より扱いやすい系となった。その結果、新たな組換えウイルスの回収にも成功し、性状解析が進んでいる。新たにCTFV VP6が増殖性に深くかかわることがわかり、研究課題を発展させた応用課題についても取り組めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は組換えウイルスに導入する外来遺伝子を最適化し、レポーターウイルスの作出を試みる。また、VP6をコードするセグメント6にいくつかの点変異を加えるとウイルス増殖性が低下することがわかった。この機序解明をリバースジェネティクス法による組換えCTFVを作出し、解析することで試みる。
動物モデルはウイルス力価が低いことを考慮し、超遠心によるウイルス濃縮を行った後に、高力価ウイルスの感染実験を再度行う。宿主の感受性を調べるために他系統のマウスやラットに対して感染させ、その病態を観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究が概ね良好に進み、本年度では想定した金額よりも使用額が低くなった。特に、高額となるトランスフェクション試薬の使用量が抑えられたことが考えられる。しかし、本年度で円滑に進められたクローニングやトランスフェクションは初歩的な人工ウイルス合成法であり、次年度に引き続き行うレポーターウイルスの回収といった発展的な実験にはより多くの消耗品等を用いる可能性が高い。
動物モデルについて、本年度ではネガティブな結果が多く認められた。これは一般的に使用される動物モデルで検討したためである。今後はより特殊な個体で検討する必要があり、購入費が大きくなる可能性がある。
また、その発展的な研究が成功した際に学会発表や論文投稿などにかかる費用も本年度より高額になることが予想されるため、次年度へ繰越す予定である。
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