| 研究課題/領域番号 |
22K15066
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
小山 亮祐 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 特別研究員 (70880681)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| キーワード | 糖鎖 / 代謝 / 出芽酵母 / マンノシダーゼ / 遊離糖鎖 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物のO-結合型糖鎖は、タンパク質のSer/Thr残基を修飾する糖鎖であり、様々な生体内プロセスに深く関わっていることが知られている。近年、その生合成経路については解明されつつあるが、その代謝系についてはほとんど知られていない。その中でもヒトから酵母までその存在が知られているO-マンノース型(OM)糖鎖の代謝機構の知見は全ての生物種で皆無である。それに対し当研究室では、出芽酵母においてタンパク質に付加されたOM糖鎖を切断・遊離させる新規の“エンド-O-マンノシダーゼ(EOMase)”様の酵素活性を発見した。そこで、本研究ではこのEOMase遺伝子および酵素の同定を行い、それらの機能解析を行うことで、O-結合型糖鎖代謝機構の解明を目的とした。本目的に対し、初めに「実験１.EOMase活性検出アッセイ方法の確立」と「実験2.遺伝子破壊株の遊離糖鎖解析によるEOMase遺伝子探索」の二つを試みている。
「実験1」では、EOMaseの酵素活性を直接的に観察するために、化学合成していただいた蛍光基質、標識タグを介して精製した15種の酵母由来糖タンパク質、酵母細胞から抽出したバルク糖タンパク質を用意した。これらを用いてEOMaseの酵素活性観察を試みている。
「実験2」では、EOMase遺伝子の破壊によって遊離糖鎖が生産されないことが予想されたことから、昨年度までで全遺伝子約6000遺伝子中1865遺伝子（昨年から約800遺伝子を追加解析）の破壊株及び機能低下株で解析を行った。その結果、EOMase遺伝子の同定には至っていないが、野生株に比べて極端に遊離OM糖鎖生成量が少ない株（2株）に加えて新たに生成量の多い株（23株）を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
「実験１.EOMase活性検出アッセイ方法の確立」では、当初計画していたHPLCでの検出条件検討は完了したが、化学合成していただいた蛍光基質での酵素活性検出に難航したため、新たに2種類の基質を準備していたことから計画は遅れている。一つは、EOMase活性による糖鎖切り出しに伴う分子量変化を観察するために、OM糖鎖が多数結合している15種類の糖タンパク質をHAタグで標識した。もう一つは、EOMase活性によって切り出しされた遊離糖鎖を観察するために、酵母から糖タンパク質をバルクで抽出、粗精製した。現在これら3種類の基質を活用したEOMase活性検出を試みている。
「実験2.遺伝子破壊株の遊離糖鎖解析によるEOMase遺伝子探索」では、目的遺伝子の同定に至っていない。また、野生株に比べて極端に遊離OM糖鎖生成量が少ない株（2株）もしくは多い株（23株）の機能とEOMaseとの関係性を解析していたが、これまでに発見された過剰に遊離OM糖鎖を生成するcyc8破壊株の表現系と異なる株が多いことから難航している。
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| 今後の研究の推進方策 |
「実験１.EOMase活性検出アッセイ方法の確立」では、昨年度新たに準備した2種類の基質を活用し、継続してEOMaseの活性検出条件検討を行っていく。活性が検出でき次第、出芽酵母の遺伝子欠損株ライブラリ等を活用し、酵素活性ベースのアッセイ法を確立し、EOMase遺伝子探索を試みる予定である。また、現在酵素源として用いている出芽酵母以外にも、分裂酵母、カビ類、昆虫、植物、哺乳動物などO-マンノース糖鎖を持つ生物細胞のライセートも作成し、活性のスクリーニングを行う。活性を検出できた場合、タンパク質自体を抽出・精製し、その配列解析を元に出芽酵母のEOMase遺伝子の同定を試みる。
「実験2.遺伝子破壊株の遊離糖鎖解析によるEOMase遺伝子探索」では、発見した遊離OM糖鎖生成量が少ない二種の遺伝子破壊株に着目した解析を引き続き行うことに加え、これまでに見出されてきたcyc8破壊株と同様に過剰に遊離OM糖鎖を生成する23株との二重破壊株を作成し、代謝経路上の優先順位を明らかすることで遊離OM糖鎖の生合成経路との関係を解析していく。
これらの実験によって、本研究の目的であるEOMase遺伝子および酵素の同定とそれらの機能解析を行い、O-結合型糖鎖代謝機構の解明を目指していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2023年度では、遺伝子の同定が達成できなかったため、論文投稿費用がそのまま試薬購入費用とした。2024年度には用途を変更することなく申請のとおりに活用させていただくことと計画している。
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