研究課題
視神経脊髄炎(NMO)では抗アクアポリン4(AQP4)抗体によりアストログリアが障害されるため髄液でグリア線維性酸性蛋白(GFAP)が上昇する。私たちはSIMOA法により急性期に血清でGFAPが上昇することを明らかにした。剖検標本の免疫染色によりNMOの血管周囲最初期病巣ではアストログリア足突起のAQP4とともに細胞膜上のconnexin (Cx)43が早期から失われることを報告した。Cx43をコードするGJA1には異なる開始コドンから始まるisoformがあり、低分子量isoformはチャネル機能を失うがRNA結合ドメインを保持しmicroRNA (miR)等を伝搬する。アストログリア特異的・時限的にCx43をinducible conditional knockout (icKO)すると、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)が軽減した。Cx43icKOマウスでは脾細胞のIL-10産生が亢進し制御性T(Treg)細胞が増加した。Exosomeは血液脳関門を通過するので、アストログリア由来のGJA1-29k発現exosomeが脳内炎症を増悪させるという新仮説を立てた。本研究の目的は、Cx43低分子量isoformを発現するグリア由来exosomeが、NMOの炎症を増幅する機序を明らかにすることである。本研究の1年目で、血清をexosomeと非exosome分画に分けて解析することで、GFAPはexosome分画に存在し非exosome分画には存在しないことを発見した。さらにNMOの急性期に末梢血exosomeでGJA1-29kが著増しGJA1-11kが著減する変化を発見した。EAE発症時には野生型ではGJA1-29k発現exosomeが著増したが、Cx43icKOマウスでは増加が消失した。つまりGJA1-29kは脳内炎症に関連していることが示された。
2: おおむね順調に進展している
本研究の1年目で、（１）血清をexosomeと非exosome分画に分けてSIMOA法で解析することで、GFAPはexosome分画に主に存在し非exosome分画には存在しないことを発見したこと。（２）NMOの急性期に末梢血exosomeでGJA1-29kが著増しGJA1-11kが著減する変化を発見したこと。なお寛解期にはGJA1-29kの増加はみられなくなった。（３）EAE急性期には野生型ではGJA1-29k発現exosomeが著増したが、Cx43icKOマウスでは増加が消失したことを発見したこと。以上の発見から、GJA1-29k発現exosomeが脳内炎症に関連していることが示されたため。（４）さらに、NMOと健常者の血清exosomeから抽出したRNAの次世代シークエンス解析により、NMOの急性期では、long intergenic non-coding RNA (lincRNA)が大きく変動していることを見出したため。
（１）NMOで血清GJA1-29k発現exosomeの各種パラメーターと臨床病理・免疫所見との関連を解析する。（２）NMO患者血清exosomeから抽出したRNAの次世代シークエンス解析により、NMOではlincRNAが急性期に大きく変動することが明らかになったので、differentially expressed RNAのKyoto Encyclopedia of Gene and Genome (KEGG) pathway解析やGene Ontology (GO)解析により、どの機能的pathwayがNMO exosomeではenrichしているかを明らかにする。（３）NMO血清exosomeでenrichしているlincRNAを、real time PCRで計測して確認し、変動しているlincRNAの機能と臨床所見との関連を検討する。（４）抗AQP4抗体陽性NMO患者血清IgGを培養アストログリアに作用させ培養上清中に放出されるexosomeのCx43とtranslational isoformを解析する。培養脾臓細胞にEAEマウス由来GJA1-29k発現exosomeを作用させTreg%、IFNγ、IL17を発現するTh1、Th17細胞をフローサイトメーターで計測する。（５）野生型及びCx43 icKOマウスのEAEで血清exosome RNAの次世代シークエンスで解析し、特徴的に変動するmiR/lincRNAを同定しqPCR法で確認する。GJA1-29k発現exosomeの各種パラメーターと臨床病理・免疫所見との関連を解析し、ヒトでの同様な解析結果と照合する。
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Neurology Neuroimmunology and Neuroinflammation
巻: 10(2) ページ: 1-13
10.1212/NXI.0000000000200081
