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in vivo実験として、Bcl2-L-13 S272Aノックインマウスを用いて横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷誘導性心不全モデルを作製した。本年度は昨年度に取得したタンパク質、mRNA、組織サンプルの解析を行った。ノックインマウスにおいても、心筋におけるnppbのmRNAレベルは野生型に比し有意な上昇を認めた。また、ノックインマウスでは野生型に比し、線維化や肥大の程度が増強していた。
in vitro実験については、Bcl2-L-13 Ser272の責任kinaseを探索するため、siRNAライブラリのスクリーニングを進めている。1次スクリーニングでは、脱共役剤であるCCCP投与により誘導されるBcl2-L-13のリン酸化を抑制するものを候補として選択した。Bcl2-L-13のリン酸化はanti-phospho-Bcl2-L-13 S272抗体による免疫染色で得られるシグナル数をカウントすることで評価した。ライブラリでは、１種類のkinaseにつき３種類のsiRNAが供与されている。そこで、3つのうち1つで60%以上のリン酸化抑制が見られるもの、3つのうち2つ以上で40%以上のリン酸化抑制が見られるものをヒットとして取得した。この結果、74の候補を得た。さらに候補を絞るために、2次スクリーニングを行っている。2次スクリーニングでは、ノックダウンにより実際にCCCPにより誘導されるマイトファジーを抑制する候補を選択する。ATP synthase抗体によりミトコンドリアを、LC3B抗体によりオートファゴソームを染色し、共局在点を計測することでマイトファジーを評価する。この実験を1次スクリーニングで得た74の候補について行っており、現時点で大半の評価が終了している。
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