| 研究課題/領域番号 |
22K16303
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
仙波 雄一郎 九州大学, 大学病院, 助教 (90816787)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 急性骨髄性白血病 / CRISPRスクリーニング |
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| 研究実績の概要 |
成人急性骨髄性白血病 (AML)は、近年の新規分子標的治療薬の登場以降も、未だ治療成績が不良であり、新規治療法の開発が喫緊の課題である。特に、癌抑制遺伝子TP53の変異は、既存の治療薬に対する治療抵抗性を示す最も強力な予後不良因子であるが、その治療抵抗性を克服する治療法は未だ確立されていない。申請者らは、TP53変異AMLが治療薬存在下で生存するために依存する経路が存在し、臨床的な治療抵抗性に関与していると考えた。本研究では、将来の薬剤開発を念頭に、複雑な細胞状態の変化をきたすTP53変異AMLが依存している経路を網羅的機能的手法により解明し、実臨床の難治性病態に関連する標的を同定することを目的とする。2022年度に申請者は、 CRISPR-Cas9システムによる全ゲノムスクリーニングの実験系を確立、実行した。Cas9を強制発現したマウスTP53野生型AML細胞を作成し、isogenicなTP53変異型AML細胞を樹立した。これらの細胞株に対し本研究では、GeCKOおよびBrie の2種類の全ゲノムsgRNAライブラリを用いた。 Cas9AML細胞にsgRNAライブララリを感染させ、約14日培養後に、各sgRNAの全sgRNAリード数に占める割合の変化をMAGeCKプログラムで解析した。その結果、2種類のsgRNAライブラリで共通してTrp53変異白血病でより細胞増殖に必要である遺伝子を抽出した。これらの遺伝子についてpathway解析を行ったところ、cell cycle phase transitionやRNA splicingに関連する遺伝子群が有意に抽出された。 現在、これらの機能的にTrp53変異白血病の腫瘍抑制に働くと考えられる候補遺伝子について、ヒト白血病患者の遺伝子変異、発現解析データを用いて治療標的となりうる遺伝子を絞り込み、機能解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、CRISPR-Cas9スクリーニング実験系を、新規に樹立したTrp53変異白血病細胞株に応用し、Trp53変異依存的に細胞障害に不利に働く候補因子を抽出しており、概ね順調に進展していると考えている。当初予定していたGeCKOライブラリに加え、近年開発されたBrieライブラリを導入することで、より再現性のある候補因子を同定することを目指した。追加で2種類のスクリーニング結果の解析を行ったことで、予定より時間を要したものの、結果として安定してスクリーニング実験を行うことが可能であり、治療標的となりうる因子を抽出し、機能解析を行うことが可能となった。以上のように、当初計画よりやや遅れが生じたものの、実験計画に沿って実験を遂行しており、概ね順調と考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、当該年度に行ったスクリーニングにより抽出したTP53依存的に機能が変化する因子について、分子メカニズムの探索を行う。特に、細胞周期調節を担う因子についてはEdu-assay, apoptosis-assayを用いて細胞増殖における機能を評価する。解析に耐えうる抗体が得られない因子については、近接標識法を導入することで、相互作用する候補因子を同定する。さらに、新規にポリクローナル抗体の作成も検討する。また、ヒトAML細胞における機能について、各種ヒト患者由来AML細胞を用いて発現解析を行う。さらに、異種移植モデルを用い、ヒト白血病細胞株で候補遺伝子を誘導的にノックダウンすることで、候補因子の白血病治療効果について評価を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度に当初予定していた内容に追加してスクリーニング結果の解析を行ったことで、候補因子の絞り込みにやや遅れが生じ、臨床検体を用いた候補因子解析を次年度に行うこととしたため、次年度使用額が生じた。次年度は、本年度に同定した候補因子について各種遺伝子変異を有する急性骨髄性白血病の臨床検体を用いて、RNA-seqおよび免疫染色を行い、TP53変異と候補遺伝子発現の相関関係を明らかにする。さらに、候補因子について異種移植モデルで誘導的にノックダウンを行い、in vivoで治療効果評価を行う。
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