|
細胞内には複数の蛋白質と核酸によって形成される膜の無い構造体（MOs：Membraneless Organelles）が存在している。MOsの形成や機能には蛋白質-RNA相互作用が重要な役割を担っている。本研究ではCRISPR/Cas13（Cas13）を応用した技術を活用し、MOs形成におけるRNA-蛋白質相互作用の役割を明らかにすることを目標とした。
Cas13とBiFCを組み合わせ、293T細胞内でMOsの可視化を行った。代表的なMOsの一つであるパラスペックルが核内に形成される様子を、ライブセルイメージングで観察した。Cas13-BiFCによって観察される蛍光シグナルが、パラスペックルの局在と一致することをRNA-FISHと蛍光免疫染色法により確認した。また、パラスペックル形成により得られる蛍光シグナルをFACSで定量した。さらにCRISPR/Cas9 knock-in（Cas9 KI）技術を用いて、内在性NONOにBiFCを導入したK562細胞株（白血病細胞株）を樹立した。
Cas13とNanoBiTの組み合わせでは、発光基質を加えることでパラスペックル形成を発光シグナルとして定量することに成功した。パラスペックル形成を促進する亜ヒ酸の投与により、発光強度が増加することを確認した。
Cas13とSplit-TurboIDを組み合わせて、MOsを構成する蛋白質を網羅的にビオチン化する系を確立した。Cas13-Split-TurboIDを遺伝子導入し、293T細胞内で形成されるパラスペックルの近接因子を網羅的にビオチン化し、LC-MS/MSを用いて網羅的に解析した。Cas9 KI技術で、内在性のNONOとパラスペックル近接因子に蛍光レポーターをKIし、細胞内で二つの分子がK562細胞内で共局在することを明らかにした。
|
