| 研究課題/領域番号 |
22K16402
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
青山 周平 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (90910563)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 膵β細胞 / 膵島 / 糖代謝異常 / 不均一性 |
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| 研究実績の概要 |
2022年度に引き続き、固定した膵臓のCUBICによる透明化およびライトシート顕微鏡による観察を継続し、典型的なオートファジー刺激である飢餓条件下におけるオートファジー活性の評価およびその定量化を試みた。試行回数を増やした結果、再現性をもって飢餓条件下におけるpHluorin/mCherry比の有意な低下を認めたことから、本マウスの透明化による膵臓全体のオートファジー活性の評価のみならず、その定量評価も可能であると考えられた。一方、透明化の過程によるpHluorinの蛍光強度の減弱を克服するための増強方法は確立できていないため、引き続きmCherryとの蛍光比をとることでオートファジー活性を評価する方針としている。透明化によるpHluorinの減弱の程度が実験手技によってばらつく事が予想されたが、ある程度の幅に収まっており試行回数を重ねれば定量化も可能と思われた。昨年度に難渋した核染色の手法に関しても、当施設のライトシート顕微鏡では、一般的に核染色で用いられているDAPIなどのpHluorinおよびmCherryと離れた位相の励起レーザーが搭載されていないため、構造物の位置関係を認識するのは引き続き困難な状況である。以前我々が行った検討では、固定したマウスの膵臓をインスリン染色や核染色後に観察することによって個々の膵島の位置関係を把握していた。その際の観察結果から膵島では膵外分泌組織と比較して、細胞密度が高いことを反映してか、pHluorin陽性細胞も多かったことからpHluorinの蛍光を用いて個々の膵島のROIを設定することも検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
申請時の計画では、2023年度中に本マウスに対して高脂肪食負荷やインスリン受容体拮抗薬であるS961を投与し、既報においては膵島内の個々膵β細胞のオートファジー活性が不均一化する条件下において、膵臓内の個々の膵島におけるオートファジー活性を評価予定であった。しかし、当施設のライトシート顕微鏡ではpHluorinおよびmCherryと離れた位相の励起レーザーが搭載されていないため、核染色と同時にオートファジー活性を定量的に評価することが困難であった。そのため、個々の膵島のROIの設定をpHluorinの蛍光強度に依存するか、pHluorinやmCherryへの漏れ込みを許容するかのどちらが選択せざると得ず、有用な実験手法の確立が未達となっている。上記を勘案して、進捗状況はやや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度の研究によって、我々が作成したオートファジー活性モニターマウスを透明化し、膵臓全体のオートファジー活性を評価する方法は一定程度、確立したと考えている。2023年度には更に試行回数を増やし、再現性の確認および定量的な評価に関しても確立したと考えられる。一方で上記のように本マウスで発現しているオートファジー活性の評価に重要であるpHluorinおよびmCherryから独立した蛍光の評価が、当施設のライトシート顕微鏡では困難であることが大きな障壁となっている。当初予定していた高脂肪食負荷やインスリン受容体拮抗薬投与といったインスリン抵抗性を増大させる手段は確立できているため、膵臓を透明化した際の上記蛍光波長以外の染色方法や個々の細胞の位置関係を認識可能な手法を引き続き模索していく。確立後は速やかに糖代謝異常条件下における膵臓全体のオートファジー活性の評価に移行したいと考えている。
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