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2023 年度 実施状況報告書

TIGITノックアウトヒトNK細胞を用いた膠芽腫に対する新規治療法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 22K16667
研究機関奈良県立医科大学

研究代表者

森本 尭之  奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (20865563)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
キーワード膠芽腫 / NK細胞 / TIGIT / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9
研究実績の概要

本研究の目的は、チェックポイント受容体であるTIGITをノックアウトしたヒトNK細胞を誘導し、各種モデルを用いたGBMに対する抗腫瘍効果の増強を示し、臨床応用に寄与できる詳細な細胞特性を明らかにすることで、NK細胞を用いたGBMに対する新規免疫治療法の確立の土台を形成することである。
2023年度には、、ヒト健常人血液からT細胞を除去した末梢血単核細胞を分離し、IL-2/IL-18の存在下で拡大培養を行った。培養7日目のNK細胞にCRISPR配列とCas9蛋白を
Nucleofectorによる電気穿孔法で導入した。遺伝子導入後に、自己血漿、IL-2含有AIM-V培地でさらに7日間培養した。増幅倍率は14日間で50倍以上を目標とし、達成された。次に、TIGIT、その他の細胞表面レセプターの発現を各種抗体とフローサイトメータ (BD社) を用いて解析した。TIGIT以外の活性型・抑制型受容体の発現に明らかな変化はなかった。DNA抽出キットを用いてDNAを単離し、polymerase chain reaction (PCR)で標的配列周辺のDNAを増幅する。増幅後のPCR産物を再び変性とアニーリングさせ、T7 Endonuclease I によりミスマッチ配列を切断し、電気泳動を行うことでTGIT遺伝子の破壊効率を確認し、良好なノックアウト効率を認めた。同時に明らかなoff target効果は認めなかった。また、RNA抽出キット(QIAgen社)を用いてRNAを単離し、Clariom S (Thermo社)を用いたマイクロアレイ解析を理研ジェネシス社等の外部委託施設に依頼した。その後、Transcriptome Analysis Console (TAC) software (Thermo社)を用いて解析を行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ヒト健常人血液からT細胞を除去した末梢血単核細胞を分離し、IL-2/IL-18の存在下で拡大培養を行った。培養7日目のNK細胞にCRISPR配列とCas9蛋白を
Nucleofectorによる電気穿孔法で導入した。遺伝子導入後に、自己血漿、IL-2含有AIM-V培地でさらに7日間培養した。増幅倍率は14日間で50倍以上を目標とし、達成された。次に、TIGIT、その他の細胞表面レセプターの発現を各種抗体とフローサイトメータ (BD社) を用いて解析した。TIGIT以外の活性型・抑制型受容体の発現に明らかな変化はなかった。DNA抽出キットを用いてDNAを単離し、polymerase chain reaction (PCR)で標的配列周辺のDNAを増幅する。増幅後のPCR産物を再び変性とアニーリングさせ、T7 Endonuclease I によりミスマッチ配列を切断し、電気泳動を行うことでTGIT遺伝子の破壊効率を確認し、良好なノックアウト効率を認めた。同時に明らかなoff target効果は認めなかった。また、RNA抽出キット(QIAgen社)を用いてRNAを単離し、Clariom S (Thermo社)を用いたマイクロアレイ解析を理研ジェネシス社等の外部委託施設に依頼した。その後、Transcriptome Analysis Console (TAC) software (Thermo社)を用いて解析を行った。他にもGSEA softwareを用いてenrichment解析を行った。

今後の研究の推進方策

まずは、in vitroで膠芽腫細胞株に対して抗腫瘍効果を増強するかの確認を行うため、Real time cell analyzerを用いて、膠芽腫細胞株の増殖抑制効果について検討を行う。さらに、我々が樹立している3D spheroid modelに対しても抗腫瘍効果の増強をもたらすかについて解析を行う。すでに我々が報告しているこのモデルは治療抵抗性が高くなっているが、我々の樹立したヒトNK細胞はこのモデルに対しても抗腫瘍効果を示した。こちらに対してTIGIT KO NK細胞の抗腫瘍効果を解析するため、同様にFlow cytometryを用いたアポトーシス解析を行う。これらの実験から、TIGIT KO NK細胞はmock NK細胞と比較し、膠芽腫細胞株から樹立した2D, 3D modelに対して抗腫瘍効果の増強をもたらすかについて検討できる。さらに重度免疫不全マウスを用いたxenograft modelを使用し、生存期間の解析も行う。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Antitumor Effects of Intravenous Natural Killer Cell Infusion in an Orthotopic Glioblastoma Xenograft Murine Model and Gene Expression Profile Analysis2024

    • 著者名/発表者名
      Morimoto Takayuki、Nakazawa Tsutomu、Matsuda Ryosuke、Maeoka Ryosuke、Nishimura Fumihiko、Nakamura Mitsutoshi、Yamada Shuichi、Park Young-Soo、Tsujimura Takahiro、Nakagawa Ichiro
    • 雑誌名

      International Journal of Molecular Sciences

      巻: 25 ページ: 2435~2435

    • DOI

      10.3390/ijms25042435

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Bulk RNA sequencing reveals the comprehensive genetic characteristics of human cord blood-derived natural killer cells2024

    • 著者名/発表者名
      Morimoto Takayuki、Nakazawa Tsutomu、Maeoka Ryosuke、Matsuda Ryosuke、Nakamura Mitsutoshi、Nishimura Fumihiko、Yamada Shuichi、Nakagawa Ichiro、Park Young-Soo、Tsujimura Takahiro
    • 雑誌名

      Regenerative Therapy

      巻: 25 ページ: 367~376

    • DOI

      10.1016/j.reth.2024.02.002

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Natural Killer Cell-Based Immunotherapy against Glioblastoma2023

    • 著者名/発表者名
      Morimoto Takayuki、Nakazawa Tsutomu、Maeoka Ryosuke、Nakagawa Ichiro、Tsujimura Takahiro、Matsuda Ryosuke
    • 雑誌名

      International Journal of Molecular Sciences

      巻: 24 ページ: 2111~2111

    • DOI

      10.3390/ijms24032111

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Antitumor effects of CIS-knockout human allogeneic NK cells in GBM2023

    • 著者名/発表者名
      森本尭之
    • 学会等名
      Neuro-oncology WEST
  • [学会発表] 膠芽腫spheroid modelにおける遺伝子発現解析とNK細胞の傷害活性についての検討2023

    • 著者名/発表者名
      森本尭之
    • 学会等名
      第27回がん免疫学会総会

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公開日: 2024-12-25  

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