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2022 年度 実施状況報告書

メカノレセプターTRPV4による椎間板変性に対する治療アプローチ

研究課題

研究課題/領域番号 22K16743
研究機関神戸大学

研究代表者

武岡 由樹  神戸大学, 医学部附属病院, 特命助教 (30943592)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2025-03-31
キーワードTRPV4 / 椎間板髄核細胞 / オートファジー / 細胞外基質代謝
研究実績の概要

本研究の目的は、ラット椎間板においてTransient receptor potential vanilloid-4 (TRPV4)の抑制および活性化が恒常性維持、すなわちオートファジーと細胞外基質代謝に与える影響を明らかにすることである。2022年度はラット尾椎椎間板髄核細胞を用いて細胞実験を行った。
機能欠失実験ではTRPV4 siRNAをリバーストランスフェクション法で細胞に導入し、炎症刺激(IL-1β添加)条件下で、タンパクを抽出してオートファジーマーカーや細胞外基質同化因子・異化関連因子をウェスタンブロット法で評価した。TRPV4の抑制により、オートファジーの有意な抑制(p62/SQSTM1の低下とLC-IIの増加)と、細胞外基質同化因子(Aggrecan, Collagen type II, TIMP1, TIMP2)の有意な減少、異化関連因子(MMP3, MMP13)の有意な増加を認めた。また、TUNEL染色を用いた細胞生存率の評価では、TRPV4抑制により細胞生存率の有意な低下を認めた。
機能獲得実験では、TRPV4アゴニストを添加して細胞を培養し、同様に炎症刺激条件も設けて、オートファジーと細胞外基質の評価をウェスタンブロット法で行った。炎症刺激下において、アゴニストによるTRPV4の活性化によりオートファジーマーカーの有意な増加を認め、細胞外基質同化因子の有意な増加と、異化関連因子の有意な低下を認めた。さらに、アポトーシスマーカーを評価し、アポトーシスの抑制(Cleaved PARP, Cleaved Caspase 9の低下とPARPの増加)が示された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定では、1年目は細胞実験を中心に行う計画であった。現在までに、計画していた機能欠失実験、機能獲得実験をほとんど完了しており、計画通りであると考えている。

今後の研究の推進方策

細胞実験においては、ウェスタンブロットによるタンパクの評価を追加する。
さらに動物実験を開始する。我々の研究室で過去に開発した、ラット尾椎静的圧迫モデルを用いて、機能欠失・獲得実験を行う。評価法はX線学的評価(椎間板高の計測)、組織学的評価(サフラニンO染色)、蛍光免疫染色である。動物モデルは最長56日飼育する予定であり、細胞実験よりも時間を要する見込みである。

次年度使用額が生じた理由

実験試薬試薬購入と、ラット飼育関連費用が若干予想を下回ったため。2年目には試薬購入とラット飼育費の若干の増額を見込んでいる。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2023

すべて 学会発表 (5件) (うち国際学会 3件)

  • [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) knockdown decreases extracellular matrix synthesis via autophagy suppression in rat intervertebral disc2023

    • 著者名/発表者名
      Tomoya Matsuo, Yoshiki Takeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Naotoshi Kumagai, Kohei Kuroshima, Yoshiaki Hiranaka, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
    • 学会等名
      69th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society
    • 国際学会
  • [学会発表] ラット椎間板においてTransient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4)がオートファジーと細胞外マトリクス合成へ与える影響2023

    • 著者名/発表者名
      松尾智哉, 武岡由樹, 張鍾穎, 由留部崇, 宮崎邦彦, 大西洋輝, 劉正夫, 熊谷直利, 黒島康平, 平中良明, 黒田良祐, 角谷賢一朗
    • 学会等名
      第52回日本脊椎脊髄病学会学術集会
  • [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4)活性化によるラット椎間板髄核細胞のオートファジーと細胞外基質合成の促進2023

    • 著者名/発表者名
      黒島康平,武岡由樹,張鍾穎,由留部崇,宮﨑邦彦,大西洋輝,劉正夫,松尾智哉,熊谷直利,平中良明,黒田良祐,角谷賢一朗
    • 学会等名
      第52回日本脊椎脊髄病学会学術集会
  • [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) knockdown decreases extracellular matrix synthesis via autophagy suppression in rat intervertebral disc2023

    • 著者名/発表者名
      Tomoya Matsuo, Yoshiki Takeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Yuji Kakiuchi, Yutaro Kanda, Ryu Tsujimoto, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Naotoshi Kumagai, Yoshiaki Hiranaka, Kohei Kuroshima, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
    • 学会等名
      SpineWeek 2023 (the International Society for the Study of the Lumbar Spine)
    • 国際学会
  • [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) activation promotes autophagy and increases extracellular matrix synthesis through AMPK pathway in rat intervertebral disc cells2023

    • 著者名/発表者名
      Kohei Kuroshima, YoshikiTakeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Tomoya Matsuo, Naotoshi Kumagai, Yoshiaki Hiranaka, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
    • 学会等名
      SpineWeek 2023 (the International Society for the Study of the Lumbar Spine)
    • 国際学会

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公開日: 2023-12-25  

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