メカノレセプターTRPV4による椎間板変性に対する治療アプローチ

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K16743
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 武岡 由樹 神戸大学, 医学部附属病院, 特命助教 (30943592)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: TRPV4 / 椎間板髄核細胞 / オートファジー / 細胞外基質代謝

研究実績の概要

本研究の目的は、ラット椎間板においてTransient receptor potential vanilloid-4 (TRPV4)の抑制および活性化が恒常性維持、すなわちオートファジーと細胞外基質代謝に与える影響を明らかにすることである。2022年度はラット尾椎椎間板髄核細胞を用いて細胞実験を行った。
機能欠失実験ではTRPV4 siRNAをリバーストランスフェクション法で細胞に導入し、炎症刺激(IL-1β添加）条件下で、タンパクを抽出してオートファジーマーカーや細胞外基質同化因子・異化関連因子をウェスタンブロット法で評価した。TRPV4の抑制により、オートファジーの有意な抑制（p62/SQSTM1の低下とLC-IIの増加）と、細胞外基質同化因子（Aggrecan, Collagen type II, TIMP1, TIMP2）の有意な減少、異化関連因子（MMP3, MMP13）の有意な増加を認めた。また、TUNEL染色を用いた細胞生存率の評価では、TRPV4抑制により細胞生存率の有意な低下を認めた。
機能獲得実験では、TRPV4アゴニストを添加して細胞を培養し、同様に炎症刺激条件も設けて、オートファジーと細胞外基質の評価をウェスタンブロット法で行った。炎症刺激下において、アゴニストによるTRPV4の活性化によりオートファジーマーカーの有意な増加を認め、細胞外基質同化因子の有意な増加と、異化関連因子の有意な低下を認めた。さらに、アポトーシスマーカーを評価し、アポトーシスの抑制（Cleaved PARP, Cleaved Caspase 9の低下とPARPの増加）が示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定では、1年目は細胞実験を中心に行う計画であった。現在までに、計画していた機能欠失実験、機能獲得実験をほとんど完了しており、計画通りであると考えている。

今後の研究の推進方策

細胞実験においては、ウェスタンブロットによるタンパクの評価を追加する。
さらに動物実験を開始する。我々の研究室で過去に開発した、ラット尾椎静的圧迫モデルを用いて、機能欠失・獲得実験を行う。評価法はX線学的評価（椎間板高の計測）、組織学的評価（サフラニンO染色）、蛍光免疫染色である。動物モデルは最長56日飼育する予定であり、細胞実験よりも時間を要する見込みである。

次年度使用額が生じた理由

実験試薬試薬購入と、ラット飼育関連費用が若干予想を下回ったため。2年目には試薬購入とラット飼育費の若干の増額を見込んでいる。

研究成果

• [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) knockdown decreases extracellular matrix synthesis via autophagy suppression in rat intervertebral disc (2023)
  • 著者名/発表者名: Tomoya Matsuo, Yoshiki Takeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Naotoshi Kumagai, Kohei Kuroshima, Yoshiaki Hiranaka, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
  • 学会等名: 69th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society
  • 国際学会
• [学会発表] ラット椎間板においてTransient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4)がオートファジーと細胞外マトリクス合成へ与える影響 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松尾智哉, 武岡由樹, 張鍾穎, 由留部崇, 宮崎邦彦, 大西洋輝, 劉正夫, 熊谷直利, 黒島康平, 平中良明, 黒田良祐, 角谷賢一朗
  • 学会等名: 第52回日本脊椎脊髄病学会学術集会
• [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 （TRPV4）活性化によるラット椎間板髄核細胞のオートファジーと細胞外基質合成の促進 (2023)
  • 著者名/発表者名: 黒島康平，武岡由樹，張鍾穎，由留部崇，宮﨑邦彦，大西洋輝，劉正夫，松尾智哉，熊谷直利，平中良明，黒田良祐，角谷賢一朗
  • 学会等名: 第52回日本脊椎脊髄病学会学術集会
• [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) knockdown decreases extracellular matrix synthesis via autophagy suppression in rat intervertebral disc (2023)
  • 著者名/発表者名: Tomoya Matsuo, Yoshiki Takeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Yuji Kakiuchi, Yutaro Kanda, Ryu Tsujimoto, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Naotoshi Kumagai, Yoshiaki Hiranaka, Kohei Kuroshima, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
  • 学会等名: SpineWeek 2023 (the International Society for the Study of the Lumbar Spine)
  • 国際学会
• [学会発表] Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) activation promotes autophagy and increases extracellular matrix synthesis through AMPK pathway in rat intervertebral disc cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Kohei Kuroshima, YoshikiTakeoka, Zhongying Zhang, Takashi Yurube, Kunihiko Miyazaki, Hiroki Ohnishi, Masao Ryu, Tomoya Matsuo, Naotoshi Kumagai, Yoshiaki Hiranaka, Ryosuke Kuroda, Kenichiro Kakutani
  • 学会等名: SpineWeek 2023 (the International Society for the Study of the Lumbar Spine)
  • 国際学会