| 研究実績の概要 |
エクソソームの効率的かつ短時間で、簡便な精製方法を確立すべく、新たに2種類の方法を施行し比較した。培養上清はコントロールとして誘導（－）群と、骨誘導群を作成し、day 0,4,7,9,14,18,21の計7回採取し、エクソソームを精製した。細胞や細胞残渣が含まれないように、培養上清を一度1500rpm(300g程度)にて5分程度遠心し上清を回収し、0.22μmフィルターを通してから使用した。
1つ目の方法はアミコンウルトラ15（メルク社）を用いて、スイングバケットローターを使用し4000gで約15-60分間回転させ、total量500μlとなるように調整した。培養上清20mlから500μｌ 1本精製された換算となり、これらのエクソソーム（Exo.）は、-80℃で保管した。2つ目の方法はDojindoのExolsolator Exosome Isolation Kitを用いて行った。こちらも最終total量は500μlとなるように調整した。こちらも同様に―80℃で保管した。エクソソーム採取最終日（分化誘導後21日）に、エクソソーム採取後に骨誘導なし群と骨誘導群のフラスコをAlizarin Redで染色し、骨分化誘導群で骨（カルシウム）が形成されていることを確認した。更に保存したエクソソームの一部を用いて、定量キットFluoroCet（Funakoshi）の蛍光法で概算量を確認した。今後はウエスタンブロッティングで定性確認予定であり、また以前他の3種の方法でエクソソームの精製比較をしているため、どの方法が良いかを確立し、in vivo の実験に移行予定である。
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