| 研究課題/領域番号 |
22K18365
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
田中 実 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (80202175)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| キーワード | 減数分裂 / 雌雄差 / 組換え / 相同染色体 |
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| 研究実績の概要 |
申請者はメダカ生殖細胞の性決定研究においてメス特有の減数分裂機構が存在することを発見し(Science 2015, PNAS 2020)、染色体高次構造を作り出すコヒーシン（REC8）が関わることを見出した。メダカには２つのrec8 遺伝子（rec8a, rec8b）が存在し、rec8a変異体はメスでのみ減数分裂が停止することから、コヒーシンの量的あるいは質的な性差が染色体高次構造を変え、組換えランドスケープの性差をもたらすと考えた。
減数分裂の性差は、染色体あたりの組換えの数や位置（組換えランドスケープ）の差として認められ、その組換えランドスケープは以下に述べる減数分裂染色体の「高次構造」と「核内動態」を基盤として形成される。本研究ではこの高次構造と核内動態に着目して解析を行う。
本研究では、高輝度高解像度のライブイメージング手法と条件的タンパク質分解法を確立し、独自の変異体を用いた核内動態解析と超解像度顕微鏡による染色体構造解析を行い、組換えランドスケープの性差をもたらす分子機構を明らかにする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
条件検討の結果、数時間にわたるイメージング画像の取得に成功した。その結果染色体の動きは、他の脊椎動物で報告されたものとは異なり、パキテン期に入って開始することが明らかとなった。また動き速度が雌雄の生殖細胞で異なる可能性を見いだしつつある。またその前段階であるザイゴテン期から染色体末端からの軸形成伸長が追えるようになった（Kameyama et al., 2024 Zool Sci）。
このとき、染色体動態を司ると考えられる微小管構造が雌雄の生殖細胞で異なり、この構造は卵の極性形成に必須のバルディアー二ボディの前駆構造であることが判明した。この構造を MT dome 構造と名付け、形成過程を調べたところ、始原生殖細胞から形成されることが明らかとなった（Kikuchi et al., 2024 Development）。一方、組換えランドスケープを調べるために、組換えマーカーとなりうる抗体の作製を昨年来続けてきたが、一般に使われている組換えマーカー MLH1/3のメダカ抗体を得ることはできなかった。そこで同じく組換え位置の成熟に関わる HEI10に着目し、メダカタンパク質を大腸菌で発現させて得て、それをウサギに免疫することで特異抗体を得ることに成功した。この結果軸伸長とともに、組換え位置の個数と場所を特定できることが可能となった。
また rec8a/b 抗体を用いたマススペクトロメトリー解析は進行中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
ある程度長い期間にわたって単離した減数分裂期の生殖細胞を培養できるようになったため、微小管構造と染色体動態との関わりを培養系を用いて調べていく。そのために相同染色体が可視化できるメダカSYCP3-tg の減数分裂期生殖細胞を用いて微小管阻害剤の有無で培養しイメージングを行い染色体動態を調べる。イメージングを行った後に細胞を固定し、微小管構造の有無を確認する。
また組換えマーカー抗体が得られたため、まず雌雄の生殖細胞での軸長性差と染色体上の組換え位置の場所と個数の性差を明らかにする。位置は相同染色体一本の中心から末端までを１００としてその相対位置で表す。その上で発現に性差が見られる相同染色体形成因子（コヒーシン）rec8a/b の変異体においても同様な解析を行い、軸長と組換えの性差を明らかにする予定である。同時にrec8a/b 抗体を用いたマススペクトロメトリー解析を推し進め、rec8a/b と相互作用する因子の同定を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
組換えランドスケープ解析における組換え位置を特定するマーカーをようやく得ることができ、現在解析を行い始めている。組換えの位置は現在、一本の相同染色体上の相対的位置で判定しているが、正確に決めることは重要である。そのためマーカーを用いた性差解析に加え、組換え位置を塩基レベルで大量に解析する方法も試みており、そのための塩基配列決定の費用（ライブラリー作製、次世代シークエンサーによる配列決定消耗品）を持ち越すこととなった。いっぽう、マススペクトロメトリー解析による因子の同定費用も持ち越すこととなった。rec8a/b 抗体を用いて免疫沈降を行い、その沈降物をゲルから抽出して質量分析計にかける。このための生化学関連試薬と質量分析に要する消耗品試薬に用いる。
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