研究課題
本研究は、遺伝性網膜芽細胞腫をはじめとした、がん抑制遺伝子RBに突然変異を有する難治性がんの未発症変異保有者に対する予防薬の開発を目的とする。研究代表者らが提唱してきた「RB再活性化がん予防法」は、RBタンパク質が後天的に失活した場合には著効する一方、RB遺伝子の突然変異により完全な機能喪失をきたした場合には効果が乏しいと考えられた。このRB変異がんに対する新たな予防戦略として、RB失活により活性化される転写因子E2Fを直接阻害する方法と、RBに類似の機能を有するファミリー分子p107、p130を活性化する方法を考案した。E2F阻害時に発現抑制され、同時にRBファミリー活性化時にも発現抑制される遺伝子として、Cyclin E1遺伝子を見出した。Cyclin E1遺伝子のプロモーター活性低下を指標としたcell-basedスクリーニングを行うことによって、E2F阻害剤とRBファミリー活性化剤を同時に発見できると考えられた。RB変異を有する網膜芽細胞腫WERI-Rb-1細胞、骨肉腫Saos-2細胞に対し、陽性対照としてpan-E2F阻害剤HLM006474、CDK2/4/6阻害剤PF-06873600を投与した際の細胞増殖、Cyclin E1 mRNA発現およびプロモーター活性の変化を調査した。いずれの薬剤も、細胞増殖抑制効果、Cyclin E1 mRNA発現低下およびプロモーター活性低下を引き起こした。さらに、PF-06873600投与時に、RBファミリーp130が活性化していることを見出した。以上より、E2F阻害およびRBファミリー活性化はRB変異がんに対する予防戦略として有用であることを実証し、Cyclin E1遺伝子のプロモーター活性低下を指標としたスクリーニング系構築に繋がる知見を得ることができた。
2: おおむね順調に進展している
当初、E2F阻害剤およびRBファミリー活性化剤は、それぞれ別の方法で探索する予定であった。しかし、これら二つの異なる作用機序を有する薬剤を同時に選別し得る「Cyclin E1遺伝子のプロモーター活性低下」という新たな指標を見出したことにより、必要実験量の半減が見込まれた。さらに、陽性対照化合物によるRB変異がん細胞株WERI-Rb-1、Saos-2の増殖抑制、Cyclin E1遺伝子発現およびプロモーター活性の低下、およびRBファミリーp130の活性化を確認し、スクリーニング系構築のために必要な情報を揃えることができた。cell-basedスクリーニングでは被験化合物の処理によって細胞数が減少し、偽陽性が生じることがある。この問題を解決するために、細胞数に比例して発光が増強するプローブと併用でき、細胞数の補正が可能なCyclin E1プロモーターベクターを構築した。以上の理由により、スクリーニングの準備は整いつつあり、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
Cyclin E1プロモーターベクターをRB変異がん細胞株に導入し、安定強制発現細胞株を樹立することにより、Cyclin E1プロモーター活性を指標とした、食品や薬品ライブラリーに対するE2F阻害剤およびRBファミリー活性化剤のスクリーニングを行う。E2F阻害剤およびRBファミリー活性化剤は、いずれもがん細胞の増殖を抑制することが期待できるため、得られたヒット化合物がRB変異がん細胞株の増殖を抑制するどうかを検討する。さらに、これまでの研究成果であるRBファミリー再活性化食品成分や薬剤を併用することで、がん細胞増殖抑制効果が増強するかどうかを検証する。最後に、RB変異がん細胞株を免疫不全マウスに移植し、ヒット化合物を投与した際の腫瘍生長抑制効果を検証する。並行し、アフィニティクロマトグラフィーを用いてヒット化合物の細胞内での結合分子を同定し、作用機序を明らかにする。
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