| 研究課題/領域番号 |
22K19268
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
荒磯 裕平 金沢大学, 保健学系, 助教 (20753726)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| キーワード | タンパク質複合体 / 高速原子間力顕微鏡 / GFP |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、クライオ電子顕微鏡解析で得られた精密構造情報と高速原子間力顕微鏡（HS-AFM）解析で得られる動的構造情報を組み合わせて、タンパク質複合体のサブユニットレベルでのダイナミクスを容易に解析できる「GFPトラッキング法」の確立を試みた。まず、６つの膜貫通サブユニットで構成される膜タンパク質複合体であるTOM複合体に焦点を当てて研究を進めた。TOM複合体のクライオ電顕構造に基づいてGFPタグを導入するサブユニットを３つ選定し、GFPタグが溶媒側に露出するように導入位置を決定した。TOM複合体の全てのサブユニットを発現させるためのカセットベクターは既に構築済みであり、本研究ではカセットベクターの任意の位置にGFPタグを導入し、出芽酵母のゲノムに発現カセットを組み込むことで、GFP導入変異体発現株を樹立した。これらの発現株を用いてGFP導入変異体の発現スクリーニングを行ったところ、３サブユニット中２つにおいてGFPが融合したサブユニットの発現を確認し、蛍光顕微鏡観察ではGFP蛍光シグナルを捉えることにも成功した。しかし、精製TOM複合体の分子量や構成サブユニットについて、ゲルろ過クロマトグラフィーやBlue Native-PAGEを用いて評価したところ、GFPタグがTOM複合体の中に効率的に組み込まれていない可能性が考えられた。Tom22サブユニットの可溶性領域にGFPタグが導入された変異体についてはHS-AFM解析まで進めることができたが、GFPと考えられる優位なシグナルを得るには至っていない。今後は、GFPの導入位置を再検討するとともに、より小さなエピトープタグを導入した変異体の準備も並行して進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
TOM複合体の任意位置へのGFPタグ導入を行い、GFPタグの発現や複合体への取り込みを評価する実験系が構築できた。GFPタグ導入位置の再検討等が必要ではあるが、一連の実験手法は確立できており、順調に研究が進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１年目の課題を克服するため、TOM複合体へのGFPタグの導入位置を再検討し、TOM複合体への取り込み効率を阻害しない変異体を探索する。また同時並行で、よりサイズの小さなHAタグを導入した「HAトラッキング法」の準備も進めていく。HAタグは９アミノ酸で構成されるためHS-AFM解析によって視認することが難しく、HAタグの位置を検出するためには抗HAタグ認識抗体を添加し、抗体の結合部位からHAタグの位置を間接的に決定する必要がある。しかし一方で、大きなGFPタグに比べると複合体形成への影響を最小限に抑えることが期待できるため、タグ導入変異体を容易に調製できる可能性がある。今後はGFPタグに加えてHAタグを並行して進めることで、タンパク質複合体の動きを追跡する「トラッキング法」を拡張して研究を進める。
また、膜タンパク質複合体であるTOM複合体以外に、可溶性タンパク質複合体にも本手法を適用し、様々なタンパク質複合体に応用していく。
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