| 研究課題/領域番号 |
22K19300
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| 研究機関 | 京都産業大学 |
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研究代表者 |
三嶋 雄一郎 京都産業大学, 生命科学部, 准教授 (00557069)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| キーワード | ゼブラフィッシュ / リボソーム / イメージング |
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| 研究実績の概要 |
mRNAがタンパク質へと翻訳される際に翻訳装置であるリボソームが衝突すると、特殊なリボソーム二量体構であるDisomeが生じる。このDisomeは、リボソーム 品質管理機構であるRQCとNGDにより解消される。しかしリボソーム品質管理機構がいつどこでどの程度起こっているのかをリアルタイムで検出する方法はまだ存在しない。本研究では、RQCとNGDを生体内で可視化する実験系を小型熱帯魚であるゼブラフィッシュの胚内で構築し、リボソームの衝突と品質管理の時空間的な分布を、個体発生過程において解明することに挑戦する。
本年度は、disome上で複合体を形成することが報告されているGIGYF2-4EHP複合体の相互作用について、試験管内翻訳によって調整したゼブラフィッシュGIGYF2-4EHPの2者の間での結合を、NanoBIT-PPI assayによって発光シグナルとして検出することに成功した。
NGDの可視化については、独自に同定した3つのNGDの標的となる内在mRNAの配列について解析を進め、野生型においてdisomeの形成を引き起こす配列が、znf598変異体ではdisome形成が増強される場合と、disome形成部位をリードスルーする場合があることを見出した。この新たな情報を加味し、レポーターを用いてdisome形成とNGDを検出するための最適配列について、新規配列のゲノムワイドな探索と、候補の見直しをおこなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Disome上で複合体を形成するGIGYF2-4EHP複合体の相互作用について試験管内翻訳系を用いて発光検出することが可能となったが、in vivoにおいて同様の検出が可能かは検討できていないため、次年度以降に行う必要が生じている。またNGDを再現するレポーター構築のためにより適した配列を再検討したため、新規に見出した配列について詳細な追加解析を行う必要が生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
Disome上で生じるタンパク質複合体について、in vitroで成功したNanoBiT-PPI assayのゼブラフィッシュ胚への導入を行う。並行して、今年度に構築したGIGYF2-4EHP複合体のin vitroでの発光検出系を拡張し、Disome上で近接することが知られているZnf598やEDF1についても、化学発光によって相互作用が検出ができるか検討を進める。
NGD再現レポーターについては、新規に見出した配列について詳細な追加解析を行い、既に同定している配列との比較を行うことで、Disome形成やNGD誘導における作用機序について理解を深める。得られた情報をもとに、Disome形成とNGD誘導を強く誘導できる天然あるいは人工改変配列を決定する。配列が決定できれば、実際にルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質レポーターを用いてDisome形成とNGD誘導の可視化が可能かどうかゼブラフィッシュ胚に導入して検討を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Disome上で形成される複合体の解析において、昨年度から持ち越したin vitroにおける追加の検証実験を実施したため、当初行う予定であったin vivoにおける実験を次年度に繰り越して実施することとなった。NGDレポーターの最適化についても、引き続きより高感度かつ高効率となる配列条件について、追加の検討の必要性が生じたため、当初の予定の一部を変更し、次年度に継続して追加の検討を行う必要が生じた。
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