| 研究課題/領域番号 |
22K19375
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小川 治夫 京都大学, 薬学研究科, 准教授 (40292726)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| キーワード | 膜タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
X線結晶解析やクライオ電子顕微鏡法（クライオEM）の発展により、G-protein Coupled Receptor (GPCR)等多くの受容体や、イオンチャネル・イオンポンプタンパク質等の膜輸送体の立体構造が報告されている。だがこれまで報告されている膜タンパク質の立体構造は、生体膜を複数回貫通する膜貫通部位を持つ、多回膜貫通型の膜タンパク質である。その一方で、膜を１回のみ貫通する、いわゆる1回貫通型の膜タンパク質の「全長構造」の報告は皆無である。その中で特に重要なものは生体にとって重要なホルモンやサイトカイン等の受容を担う1回貫通型受容体である。だが、1回貫通型受容体は膜貫通領域を1本しか持たないことなどもあり、大量発現・精製や、その後の立体構造解析へ向けたハンドリングが極めて困難であることが知られている。以上のことを考え合わせると、膜1回貫通型受容体の立体構造解析は構造生物学における最後のフロンティアと言っても過言ではないかもしれない。そこで、本研究では申請者のこれまでの研究を発展させ、研究代表者の独自の大量発現・精製技術を駆使することで、この「構造生物学における最後のフロンティア」である膜１回貫通型受容体の生理的状態での構造をクライオ電子顕微鏡により決定することを目指す。これにより、膜１回貫通型受容体での膜を隔てた信号伝達機構・基質認識機構の解明を行うことが可能になると考えられる。令和5年度は令和4年度に引き続き、大量精製した精製標品のナノディスクへの再構成をより効率的に行う手法の検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
膜１回貫通型受容体を培養細胞に定常的に発現させ、界面活性剤で可溶化後、タグを用いて精製を行っている。得られた精製標品については生理活性の測定を行い、十分な活性を有していることが確認された。本年度は昨年度に引き続きナノディスクへの再構成を試みたが、より効率的に組み込む手法の検討を行った。精製標品はナノディスク再構成後にも活性を有していたが、再構成されていない空のナノディスクも多数存在した。そこで、ナノディスクへの再構成後、更にタグを用いた精製を行うことでこの問題も概ね解決した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の研究により、ナノディスクへの再構成の効率も上がった。だが依然として構造解析には不十分である。そこで、本年度は再構成の際の脂質成分を変える等の工夫や、その他再構成の手法の検討を行うことで、ナノディスクへの再構成効率を上昇させる。もし、十分量が再構成されたなら、構造解析への転用を考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
依然としてナノディスクへの再構成に問題があり構造解析を全力行うには至っていない。そのために、電顕用グリッドのために充てていた費用を今年度のために持ち越した。
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