| 研究課題/領域番号 |
22K19442
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| 研究機関 | 大阪公立大学 |
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研究代表者 |
坪内 泰志 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (30442990)
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| 研究分担者 |
仁木 満美子 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20438229)
金子 幸弘 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 教授 (90469958)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| キーワード | 抗アシネトバクター活性 / 深海性放線菌 / 天然物化学 / ゲノム解析 / 精製・構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
令和4年度では研究課題対象であり薬剤耐性化が危惧されている「ESKAPE」の一種であるAcinetobacter baumanniiに抗菌活性を呈する深海・海洋性放線菌のうち2株のMicromonococcus sp.に対して、活性物質の精製法確立および、生産菌ゲノム解析を行なった。本研究ないで実施された耐熱性試験、有機溶媒安定性試験、限外濾過分子サイズ推定などにより、当該活性物質がペプチド性分子であることが推察されたため、活性物質の精製においては硫酸アンモニウム沈澱濃縮、親水性クロマトグラフィーの一種であるHILIC系Preparative HPLCシステムを用い、精製を進めた。活性評価にはA. baumannii ATCC19606、弊学附属病院で分離された多剤耐性A. baumannii OCUAc-19, 0CUAc-20、そして当教室で作製したA. baumannii膜構造変異株を用い、精製各段階での活性の追跡、および比活性算出に用いた。活性分子はまだ単一分子の精製までに至っていないのが現状ではあるが、LC-MS-QTOF分析からは主たるピークとして確認できている。生産菌ゲノム解析では、long read dataにはONT社MinIONシステム、short read dataにはIllumina社NovaSeq、ないしはMGI社 のDNBSEQ T7を遂行し、2プラットフォームを採用した。得られた各データからopen source codeによるバイオインフォマティクス手法でwhole genome配列を構築することに成功し、コードされている16S rRNA遺伝子を指標とした分析からはいずれも新種株に相当することが見出された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
【活性分子特性解析】においては抗A. baumannii活性物質の精製・構造解析を中心に研究を進めている。活性が認められた深海・海洋性放線菌のうち活性強度を基準として順次分析を進めており、令和4年度では2株のMicromonococcus sp.に対して、活性物質の精製法検討および、生産菌ゲノム解析を行なった。研究結果から当該活性物質がペプチド性分子であることが推察されたため、硫酸アンモニウム濃縮や陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーを主体とするタンパク質精製に準拠した手法を採用し、精製を進めている。現状ではまだ完全精製に至っていないものの、LC-MS-QTOF分析からは主たるピークとして確認できている。
【微生物学的解析】においては生産菌の特性解析を進め、資化性や形態学的観察を主とする表現型識別による分類およびキノン同定による化学的分類を完了した。また次世代シーケンサーを用いた生産菌ゲノム配列解析を進めており、R4年度の解析対象とした2株のMicromonococcus sp.に対して完全長ゲノム配列の決定に至った。
【基礎医学的解析】においてはA. baumannii呼吸器感染および血流感染マウスモデル作製の端緒についたところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
【活性物質特性解析】においては、完全精製に至っていない抗A. baumannii活性物質の精製・構造解析を中心に研究を進める。当該物質がペプチド性であることを鑑み、フィンガープリンティングMSによりその一次配列を同定し、立体構造を形成する結合様式は一次元・二次元NMRやFT-IRを用いて推定する。順調に進んだ場合は、まだ手掛けていない深海・海洋性放線菌株に由来する抗A. baumannii活性物質の精製・構造解析にも取り掛かる。
【微生物学的解析】においては、その特性解析が進行中である2株のMicromonococcus sp.に対して細胞壁構成アミノ酸や細胞内脂肪酸組成を実施することで生産菌の化学的分類を同定する。また、トランスクリプトーム解析を行うことで、その遺伝子発現強度の差異で生合成遺伝子群や生合成経路の同定を試みる。その際は、R4年度に同定した生産菌ゲノムデータを鋳型とし、活性物質生産条件（生産時期等）に焦点を絞り、生産菌の培養時期別で抽出したTotal RNAから解析したNGSデータを同配列にマッピングすることで実施する。
【基礎医学的解析】においては、活性評価に用いた4株のA. baumannii株（ATCC19606, OCUAc-19, 0CUAc-20, 膜構造変異株）を基に、抗菌効果の確認が取れた株により呼吸器感染および血流感染マウスモデルの作成を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究開始当初、追いかけている活性化合物は低分子有機化合物と推定しており、物質精製や研究手法も既設の装置を使用していた。しかしながら研究が進むにつれて「ペプチド性である」というデータの基で方向転換することとなったが、対応する分析・分取用カラムをはじめとした消耗品類の国内欠品が続いており、それらの納期が予算執行締め切りに間に合わないと見込まれたため、次年度予算での購入に持ち越すこととなった。
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