研究課題
乳がんの70%を占めるエストロゲン受容体（ER）陽性乳がんは、高い頻度で再発するという深刻な問題がある。これは、がんが治療環境に耐えて生き抜く際に発揮する適応力に由来するものと推察されるが、詳細は不明である。従来、遺伝子の転写は、遺伝子の転写開始点付近のクロマチンに転写因子がアクセスしやすくするといったクロマチンリモデリング、ヒストンの修飾などのエピジェネティックな制御によるとされている。さらに、転写制御領域であるプロモーターとエンハンサー領域への転写因子やRNAポリメラーゼIIのリクルート、メディエーターと呼ばれる仲介タンパク質によるプロモーターとエンハンサー間の相互作用の成立などの機序もよく知られている。一方、ER陽性乳がんの再発過程では、ERをコードするESR1遺伝子の転写が活性化されるが、その様式は通常とやや異なる。ESR1を含む0.7 Mbのゲノム領域から一群のノンコーデイングRNAエレノアが転写されて細胞核内でRNA構造体であるクラウドを形成し、ESR1遺伝子とその近傍の乳がん関連の3遺伝子の転写を活性化する。つまり、合計で4つの遺伝子を含む巨大クロマチンドメインから一斉に異常（クリプティック）な転写がおきて、それに伴って近傍のmRNAの転写が誘導されると考えられる。このクリプティックな転写により形成されるRNAクラウドは、近傍の遺伝子が転写されやすい “場”となっていると推定される。これらの事象の結果、がんの増殖遺伝子の発現異常となり、治療抵抗性が獲得される。本研究では、このクリプティックな群発的転写の本態を解明することを目的としている。従来とは全く異なる新しい転写制御の実態、機序、機能を明らかにする。再発乳がんの新しいエピジェネティクス機序の発見と、病態解明に迫る。
2: おおむね順調に進展している
本年度は下記の実験に着手し、現在も進行中である。(1)再発乳がんにおける群発的クリプティック転写の実態を解明する： クリプティックな転写を伴ってカノニカルなmRNAの転写活性を示すESR1遺伝子座について、クリプティック転写開始点の解析を行った。またRNAプルダウン法などによりRNAに結合する因子を同定して機能解析することを検討した。従来の手法ではコントロールとの差が出にくいといった結果を得たので、CRIPR-dCas13の変法を用いてエレノアRNAの近傍にあるタンパク質にビオチン修飾が導入される方法を検討することとした。現在CRISPRの細胞への導入効率や、ガイドRNAの標的塩基配列の最適化を行っている。(2)クリプティック転写に関わる因子を同定する：再発乳がんモデルLTED細胞を用いたRNA-Seqやその他のSeq解析を行い、クリプティック転写開始を伴って転写制御を受ける遺伝子群をゲノムワイドに同定を試みた。得られた候補遺伝子について、FISH解析を行い、LTED細胞でクラウドを形成することを指標にして調べ、複数の候補遺伝子群を見出した。
(1)再発乳がんにおける群発的クリプティック転写の実態を解明する： クリプティックな転写を伴ってカノニカルなmRNAの転写活性を示すESR1遺伝子座について、クリプティック転写開始点を決定する。またCRIPR-dCas13の変法を用いてエレノアRNAの近傍にあるタンパク質にビオチン修飾が導入される方法を推進する。CRISPRとガイドRNA導入を最適化し、また、コントロール実験との比較を行う。(2)クリプティック転写に関わる因子を同定する：再発乳がんモデルLTED細胞を用いたCAGE-SeqとRNA-Seqを行い、クリプティック転写開始を伴って転写制御を受ける遺伝子群をゲノムワイドに同定し、それらに共通する特徴を抽出する。(3)再発乳がんにおけるクリプティック転写とRNAクラウドの機能を解明する：クリプティック転写に関わる因子をLTED細胞でノックダウンする(siRNA)。または、dCas9融合タンパク質を発現させることにより、ゲノムの特定部位に異所的にクリプティック転写を誘導することを検討中である。これらの実験については最適な因子を検索中である。「RNA Pol II convoy」のメカニズムについて、転写の開始、伸長のいずれに原因があるかなどを調べてゆく。
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すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 3件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (18件) (うち国際学会 3件、 招待講演 15件) 図書 (2件) 備考 (2件) 産業財産権 (1件)
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