| 研究課題/領域番号 |
22K19493
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
立川 正憲 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (00401810)
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| 研究分担者 |
田丸 浩 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (50324554)
船本 健一 東北大学, 流体科学研究所, 准教授 (70451630)
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| 研究期間 (年度) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| キーワード | 血液脳関門 / 輸送体 / 抗体 |
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| 研究実績の概要 |
血液脳関門(Blood-Brain Barrier, BBB)は、脳への薬物ターゲティングの障壁となる。近年、タンパク質などの高分子薬物とヒトBBB受容体に対する抗体を結合させた抗体薬物複合体が上市され、BBBの受容体介在型トランスサイトーシス（RMT）機能を利用したBBB突破法の開発研究が進められている。そこで本研究では、スイホウガンを用いてBBBにおいてRMTの第一ステップとなる受容体介在型エンドサイトーシス機能を有する受容体を同定することを目的とした。昨年度までに構築したマウス免疫によるBBB突破抗体の取得法を応用し、本年度はスイホウガンを用いて、ヒト脳微小血管内皮細胞の細胞膜タンパク質に結合する抗体を作製することを目指した。脳微小血管内皮細胞(hCMEC/D3細胞)の細胞膜画分を抗原として、スイホウガンの水泡内に免疫した後、水泡液を回収した。マンナン結合タンパク質アガロースカラムを用いて、水泡液中のIgM抗体(goldfish-IgM)を精製・濃縮した。hCMEC/D3細胞の細胞膜画分を免疫したスイホウガン由来goldfish-IgMを一次抗体として用い、hCMEC/D3細胞の細胞膜画分タンパク質に対する抗体結合性を評価した結果、50kDa付近にバンドが検出された。一方で、細胞膜を免疫していないスイホウガン由来goldfish-IgMを一次抗体として用いた際には、バンドは検出されなかった。さらに、免疫沈降とプロテオミクスを組み合わせた手法を用いた結果、hCMEC/D3細胞の細胞膜タンパク質に対する抗体と結合する膜タンパク質として、26種類の受容体候補分子を同定した。その中には、エンドサイトーシス活性を有する膜タンパク質が含まれていた。以上の結果から、スイホウガン水泡液からのgoldfish-IgM精製系を確立するとともに、抗ヒト脳微小血管内皮細胞抗体が作製されたことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画の通り、スイホウガンの水泡液中から、マンナン結合タンパク質アガロースカラムを用いて、IgM抗体を精製・濃縮する手法を確立した。スイホウガンの水疱液にヒト脳微小血管内皮細胞の細胞膜画分を免疫することで、スイホウガン由来抗ヒト脳微小血管内皮細胞抗体を取得した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒト脳微小血管内皮細胞の細胞膜画分を免疫後の水疱液から、一本鎖抗体となる単鎖可変領域フラグメント(scFv)の取得を目指す。さらに、分子生物学の専門家からの助言を仰ぐことによってライブラリを構築し、BBBトランスサイトーシス抗体の選別を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ヒト脳微小血管内皮細胞の膜タンパク質に対するスイホウガン抗体のスクリーニング系構築に関する予備検討を、2025年度に継続して実施することとしたことに伴い、本実験に要する消耗品購入費分として次年度使用額が生じた。次年度使用額は、翌年度分として請求した研究費とあわせて、2025年度にスイホウガン抗体の発現系構築のための消耗品を購入する予定である。
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