| 研究課題/領域番号 |
22K20615
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
横江 祈 鳥取大学, 農学部, 特命助教 (30953161)
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| 研究期間 (年度) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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| キーワード | 予備実験 / 実験条件の設定 |
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| 研究実績の概要 |
超音波と5-アミノレブリン酸(5-Amino levulinic acid: 5-ALA)の併用による音響力学療法(Sonodynamic therapy: SDT)は、がんに対する 局所療法として注目されている。申請者は、マイクロバブル製剤であるリピッドバブル(Lipid bubbles: LBs)、5-ALAおよび低強度超音波(Low-intensity ultrasound: LIUS)を併用することにより、有効性の高いSDTを開発することを着想した。本研究では、5-ALA、LBsおよびLIUSを併用したSDT（5-ALA-LBs-SDT）の抗腫瘍効果に関する基礎的検討を実施した。令和4年度では、1) マウス乳癌細胞株であるEMT-6に5-ALAを添加し、蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、代謝産物であるPpⅨの蓄積が確認された。2) また、腫瘍細胞に対する5-ALA-LBs-SDTの殺細胞効果の評価系を確立するために、種々の実験条件にて予備実験を実施した。初めは、プレート底面からの超音波照射を行っていたが、超音波散乱の影響か再現性のある実験結果が得られなかった。そのため、プレートの蓋を外し、液面に直接プローブを接触させて超音波照射をする方法に切り替えた。また、12wellプレート、24wellプレート、48wellプレート、96wellプレートを用いて実験を行ったが、48wellプレートよりウェル径が大きいプレートでは、ウェルの辺縁の細胞に超音波が均一に照射されておらず、実験結果にばらつきが生じやすくなった。そのため、96wellプレートを用いて実験を実施した。その結果、安定的な実験結果を得られることが明らかとなったため、以降は上記の方法にて予備実験を実施した。予備実験の結果、適切な実験条件の目安が付いたため、今後はこれらの予備実験の結果を基に本実験を遂行する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
事前の研究計画では、令和4年度に本実験まで実施できる予定であった。しかし、適切な実験条件の設定のために、想定以上に繰返しの予備実験が必要であったため、当初の計画よりも進捗は遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度には、本実験として腫瘍細胞に対する5-ALA-LBs-SDTの殺細胞効果を評価する。EMT-6を96穴プレートに播種し、セミコンフルエントとなるまで培養する。5-ALAの添加4時間後、LBsを添加し、理学療法用超音波治療器（伊藤超短波株式会社）を用いてLIUSを照射する。24時間後の細胞生存率をMTTアッセイにより算出する。次に、犬の自然発祥がん由来の腫瘍細胞株を対象に、上記と同様の実験を行う。また、5-ALA-LBs-SDTの殺細胞効果の機序の解明のために、以下の実験を実施する。音響感受性物質を用いたSDTは、活性酸素種による酸化的損傷がアポトーシスを誘導するとされている。そこで、LBsを併用した際にも同様の機序により細胞死が生じるかを評価する。はじめに、上記実験と同様の手技で、各種腫瘍細胞に対して5-ALA-LBs-SDTを実施する。1時間後、トリプシンにより細胞を剥離・収集し、Muse Oxidative Stress kitを用いて活性酸素量を測定する。次に、カスパーゼ阻害薬であるZ-VAD-FMKを培養液に添加し、その後に各種腫瘍細胞に対して5-ALA-LBs-SDTを実施する。照射24時間後の細胞生存率をMTTアッセイにより算出し、アポトーシス抑制による殺細胞効果の変化を観察する。
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